幽门螺杆菌悉尼标准菌株传代培养方法研究

樊玉娟，李福兴，王 黎，程明璟，肖 敏，熊苗苗，赵卫东

（大理大学临床医学院，云南大理 671000）

幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H.pylori）于1984年由Marshall和Warren首次从胃黏膜组织成功分离〔1〕。近40年，随着对H.pylori研究的深入，发现H.pylori感染是严重胃炎相关疾病的重要危险因素，包括消化性溃疡、胃黏膜相关淋巴组织淋巴瘤以及胃癌〔2〕。据流行病学统计，在中国，约70%的人感染H.pylori，其中15%~20%的感染者出现临床症状；在发展中国家，70%~90%的人在10岁前携带H.pylori；但在发达国家，H.pylori感染的流行率从25%~50%不等〔3〕。世界卫生组织将H.pylori列为胃癌的一类致癌因子〔3〕。虽然目前临床已有多种检测H.pylori的方法，但H.pylori培养仍是诊断其感染的金标准。由于H.pylori的培养条件高、对环境要求极其严苛，并且不能与其他细菌在同一实验室培养，故目前国内外常采用的培养H.pylori的方法成本较高。幽门螺杆菌悉尼标准菌株（SS1菌株）是最常见的H.pylori菌株之一，目前主要用于动物模型的建立以及细胞模型的感染〔4〕。本文通过对SS1菌株进行传代培养，旨在寻找一种廉价、简单、有效、快捷的H.pylori培养方法。

1 材料

幽门螺杆菌悉尼标准菌株（SS1菌株）购买于广州微生物所（GDMCC 1.1820）；哥伦比亚血平板（郑州安图生物工程股份有限公司）；胎牛血清（天杭生物科技股份有限公司）；脑心浸润液（青岛海博生物技术有限公司）；厌氧产气包（青岛海博生物技术有限公司）；密封厌氧袋（青岛海博生物技术有限公司）；MGCC-31 2.5 L密封培养罐（三菱瓦斯化学株式会社）；CO2培养箱（赛默飞世尔科技有限公司）；MVS-38立式压力蒸汽灭菌器（日本松下电器产业株式会社）；禾信康元CMI-1600飞行时间质谱仪（广州禾信仪器股份有限公司）；一次性接种环（唐人康医疗器械有限公司）；OLYMPUS CX21FS1显微镜（日本奥林巴斯株式会社）。

2 方法

2.1 前期准备 将SS1菌株甘油冻存液1 mL迅速解冻，分装于5支冻存管中，200 μL/支，放入-80℃冰箱。配制脑心浸润液：称取3.85 g脑心浸润液肉汤，溶解于100 mL去离子水中，缓慢、充分搅拌至完全溶解。准备50 mL甘油倒入玻璃瓶中，将甘油和自配的脑心浸润液高温高压灭菌30 min。甘油和自配脑心浸润液按照1∶4的体积比配制成液体培养基，分装在经高温灭菌的10 mL离心管中，备用。

2.2H.pylori培养方法

2.2.1 方法一 向哥伦比亚血平板（10个）中加入50 μL脑心浸润液，取出SS1菌株冻存液，37℃水浴解冻，使用无菌一次性接种环（10 μL）分别沾取5次菌液（共50 μL），均匀地将SS1菌株接种在哥伦比亚血平板上，随后放入装有厌氧产气包的密封厌氧袋中，每个袋子中置入1个已完成接种的哥伦比亚血平板，密封后放入CO2培养箱，观察3~14 d。

2.2.2 方法二 向哥伦比亚血平板（5个）中加入50 μL脑心浸润液和50 μL解冻菌液，使用无菌一次性接种环均匀涂布。在密封培养罐中培养，需要检查密封培养罐的密封性是否良好，然后在密封培养罐对应的凹槽中倒入灭菌后的去离子水，并放置1个厌氧产气包，最后放入已完成接种的哥伦比亚血平板，密封后放入CO2培养箱中，观察3~14 d〔5〕。

2.2.3 方法三 向哥伦比亚血平板（5个）中加入50 μL脑心浸润液和50 μL解冻菌液，使用无菌一次性接种环均匀涂布。在方法二的基础上使用烛缸法消耗密封培养罐中的氧气，即在密封培养罐中加入1支点燃的蜡烛，盖上盖子，待蜡烛熄灭后放入CO2培养箱中，观察3~14 d〔6〕。

2.2.4 方法四 向哥伦比亚血平板（5个）中加入50 μL脑心浸润液和50 μL解冻菌液，使用无菌一次性接种环均匀涂布。培养条件同方法三，与之不同的是需要每天在密封培养罐中点燃1次蜡烛。

2.3 复苏实验 使用无菌一次性接种环缓慢刮拭哥伦比亚血平板上的菌落，将菌落溶于液体培养基，并分装于1 mL冻存管中，置于-70℃冰箱保存备用。复苏当天，随机取出1支冻存管，37℃水浴解冻，并接种于哥伦比亚血平板中，使用方法四进行培养，观察3~14 d。

2.4H.pylori菌株鉴定（1）菌落形态：观察哥伦比亚血平板中的菌落形态是否典型。（2）革兰染色：滴1滴0.9%氯化钠溶液于干净载玻片上，用无菌一次性接种环刮取少许菌落在0.9%氯化钠溶液中涂开，制成厚薄适宜的细菌涂片。涂片用火焰固定，待涂片冷却后，滴加结晶紫进行初染，染色1 min，清水洗净涂片；滴加碘液进行媒染，染色1 min，清水洗净涂片；滴加丙酮乙醇进行脱色，直至无蓝紫色液体流出，清水洗净涂片；滴加稀释复红进行复染，染色30 s，清水洗净涂片，干燥后使用油镜观察染成紫红色的待测菌涂片。（3）质谱检测：将H.pylori菌液直接涂布至靶板，用甲酸破坏细菌细胞壁，添加适量仪器配套基质，干燥后放入靶仓，进行检测。根据细菌质核比（m/z），计算机软件分析得到最匹配菌株。

3 结果

3.1H.pylori菌株培养及鉴定 采用上述4种方法均能成功培养出H.pylori菌株。从哥伦比亚血平板中均观察到大小不一、半透明状、圆形菌落，此为H.pylori菌株肉眼观察的典型形态。见图1A。为进一步验证是否为H.pylori菌株，将其做成细菌涂片，并进行革兰染色。镜下可见革兰染色阴性，细菌形态呈S形、弧形弯曲、海鸥状〔7〕。见图1B。在复苏实验中观察到相同菌落，证明本实验中冻存菌株的方法是可行的。

图1 H.pylori菌株鉴定

3.2H.pylori菌株质谱检测结果 飞行时间质谱仪是一种新型的微生物鉴定仪器，与传统检测方法相比，具有灵敏度高、特异性强、分析速度快的优势。相关研究表明，当细菌最高峰位处于m/z值6 900~7 000时，该菌株即为H.pylori〔8〕。本实验中，细菌最高峰位m/z值为6 964.1，与文献〔10〕报道一致，确定该菌株为H.pylori。见图2。

图2 H.pylori质谱检测结果

3.3 不同培养方法生长速度比较4种方法均能成功培养出H.pylori菌株，通过测定哥伦比亚血平板上的菌落数，对4种培养方法的生长速度进行比较。结果显示，在达到同等菌落数量的情况下，方法四用时显著少于其他3种方法，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。

表1 4种培养方法生长速度比较（d，±s）

表1 4种培养方法生长速度比较（d，±s）

注：方法四与方法一比较*P<0.05；方法四与方法二比较#P<0.05；方法四与方法三比较△P<0.05。

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4 讨论

H.pylori是一种单极、多鞭毛、末端钝圆、螺旋形弯曲的细菌，革兰染色阴性，有动力，在胃黏膜上皮细胞表面常呈典型的螺旋状或弧形，与本实验革兰染色镜下观察的菌落形态相一致。肉眼观察呈灰白色、半透明、颗粒状菌株，与哥伦比亚血平板中呈现的菌落形态相一致。H.pylori菌株的培养条件相对较为严格，通常需要在特定的培养基中培养，并且需要在培养基中添加一定的营养物。研究报道表明，脑心浸润液和胎牛血清可以作为首选的培养基营养物，对H.pylori的生长起着重要的促进作用〔9-10〕。同时，H.pylori的生长与环境中的气体有着密切的关系，因此，还需要严格把控气体浓度〔9-10〕。正常情况下，空气中O2占21%、CO2占0.03%，H.pylori的标准培养环境是在三气培养箱（O2：2%~8%，CO2：10%~15%，N2：85%）中进行培养，这种培养箱可以严格控制O2和CO2浓度，从而为H.pylori的生长提供适宜环境，但是三气培养箱价格高昂，使其应用受限。有研究者采用烛缸法培养H.pylori，此方法成本较低，可有效进行H.pylori菌株的传代培养，但操作较为复杂〔6〕。

H.pylori对培养环境的要求极为严格，特别是低氧环境，在本研究中，方法一仅使用了装有厌氧产气包的密封厌氧袋，袋内气体由厌氧产气包产生，它可以消耗袋内的O2产生CO2，但湿度不够，由于袋内气体达到适宜比例的速度较慢，导致传代时间长；方法二是在密封培养罐中培养，罐中相应凹槽内放入去离子水，培养罐内气体主要由厌氧产气包产生，它可以消耗罐内的O2产生CO2，由于仅存在厌氧产气包，罐内气体达到适宜比例的速度仍较慢，故菌株培养时间也比较长，但优于方法一；方法三是在密封培养罐内点燃蜡烛，蜡烛燃烧可以消耗O2产生CO2和水，这样可以保持低氧环境和适宜比例的CO2，使得罐内气体快速达到H.pylori生长的最适比例，但随着细菌生长繁殖消耗掉一定量的CO2，使得气体比例不断发生变化，因此，H.pylori生长并未达到最理想的效果；方法四是在方法三的基础上增加蜡烛点燃次数，即每天都打开密封培养罐的盖子点燃1次蜡烛，这样可以使罐内持续保持H.pylori生长的最适气体环境，因此，H.pylori生长效果较好。但本实验也有相对局限性，首先由于不具备合适的培养箱，为了选择较为合适的培养环境，只选择了CO2培养箱进行培养，而未在普通空气培养箱中进行实验，在未来的研究中，将进一步探索使用普通空气培养箱的培养方法。

综上所述，通过比较SS1菌株的传代培养方法，找到一种操作简便、价格低廉的H.pylori培养方法，可有效节约H.pylori感染的研究成本，具有较强的应用前景，值得推广。