水溶性蜂胶对酒精加重溃疡性结肠炎发作的影响和机制研究

张 平，方 琼，周 华

（安徽医学高等专科学校，合肥 230601）

溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是炎症性肠病（inflammatory bowel diseases，IBD）的主要形式，它是一种终身性疾病，其特征是持续的/弥漫性的炎症，可从直肠近端扩散，并定位于结肠黏膜，主要的临床表现为腹部疼痛、便血、体质量减轻、结肠缩短及贫血等〔1〕，特征是无症状缓解和活动性疾病发作的不断循环〔2〕。它的发病机理涉及遗传和环境因素之间复杂的相互作用，是由各种遗传倾向的患者对肠道内容物不受控制的免疫反应诱导，是一种免疫炎症性疾病，已日渐成为导致生活质量恶化和公共医疗系统负担增加的公共卫生问题。

流行病学模式的变化提出饮食因素是UC加重的潜在触发因素，临床数据证实，UC患者中饮酒者复发的风险更高，且UC患者在饮酒后出现的胃肠道症状比肠易激综合征患者更严重。但“酒文化”是社交场合不可避免的，很多UC患者饮酒很常见。对酒精如何加重UC发作尚未得到深入研究。

文献〔3〕报道，饮食中富含多酚、黄酮的水果和蔬菜的摄入量与UC低风险相关。蜂胶是大自然中天然的宝藏，是一种天然的抗生素，由觅食的蜜蜂从不同种类植物的芽和渗出物中收集树脂物质，与蜜蜂唾液中的β-糖苷酶混合而成，其主要成分是黄酮类化合物，具有较强的抗氧化特性以及调节免疫反应和肠道微生物群的能力〔4〕，是治疗UC的一种候选药物。本研究采用葡聚糖硫酸钠（dextran sulfate sodium，DSS）建立UC大鼠模型，随后接受“酗酒”模式，检测酒精对DSS诱导的大鼠结肠炎症的影响，同时评价水溶性蜂胶对酒精加重的UC发作时结肠炎症的缓解作用并对其作用机制进行初步探讨，为UC患者饮酒安全提出可靠建议。

1 材料与方法

1.1 动物 雄性SD大鼠（SPF级）40只，体质量180~200 g，购自济南明悦实验动物繁育有限公司，许可证号：SCXK（鲁）20190003。实验前4 d适应性笼养于12 h/12 h光/暗循环环境中（室温18~25℃，相对湿度50%~65%），室内安静，通风正常，自由饮水和食用全价颗粒饲料。

1.2 试剂 水溶性蜂胶（纯度>98%，广州市杰禾蜂业有限公司，批号：20210325-B）；DSS（分子量：36 000~50 000 Da，美国Sigma公司，批号：S5036）；白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）、白细胞介素-17（IL-17）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）检测试剂盒（均购自合肥博美生物科技有限责任公司，批号分别为：200-06；210-10；210-17；315-01a）；美沙拉嗪肠溶片（合肥市蜀山区润吉化学试剂经营部，批号：181003）。

1.3 主要仪器-80℃超低温冰箱（Thermo公司）；倒置显微镜（Olympus公司）；Model-680酶标仪（Biorad公司）；FA2004电子天平（天津天马衡基仪器公司）。

1.4 分组、给药及造模 将大鼠随机分为5组，分别为对照组、UC组、UC+酒精组、UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组，每组8只。UC+酒精+蜂胶组大鼠每天灌胃蜂胶溶液200 mg/kg，UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠每天灌胃美沙拉嗪溶液50 mg/kg，其余各组每天灌胃等量蒸馏水，灌胃剂量0.2 mL/10 g，连续灌胃17 d。在给药7 d后，对照组大鼠自由饮用蒸馏水，其余4组自由饮用4% DSS溶液，连续7 d。第15天，各组停止饮用DSS溶液，UC+酒精组、UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组灌胃50%乙醇溶液，连续3 d，以模拟“酗酒”模式，其余组灌胃等量蒸馏水。第18天，将各组大鼠麻醉后颈椎脱臼处死。

1.5 结肠炎程度评估

1.5.1 疾病活动指数检测 自开始饮用DSS溶液起（第0天），每天固定时间测量各组大鼠体质量、粪便稠度及便血，计算疾病活动指数（disease activity index，DAI）：DAI=体质量变化百分数+粪便稠度分数+便血分数。评分标准依据文献〔5〕。见表1。

表1 DAI评分标准

其中，大鼠体质量变化百分数计算公式：体质量变化百分数（%）=（（第X天体质量-第0天体质量）/第0天体质量）×100%。使用隐血检测试剂盒检测大鼠便血情况，具体操作步骤参照试剂盒说明书。

1.5.2 结肠长度、质量及结肠质量指数检测 大鼠处死后，沿腹中线切开大鼠腹部，暴露直肠，剪取直肠至回盲肠交界部的整段结肠，置于自制冰床上测量结肠长度；将结肠沿纵轴剖开，用预冷0.9%氯化钠溶液冲洗，清理结肠内容物，置于滤纸上吸干，测量结肠质量；计算结肠质量指数（%）=（结肠质量/大鼠体质量）×100%。

再取中段结肠0.5 cm，对每只大鼠的结肠组织进行分析。其余结肠组织置于冻存管中，于-80℃冷冻保存。

1.5.3 结肠组织学评分（histological score，HS） 结肠标本用4%多聚甲醛固定，95%乙醇脱水，石蜡包埋，制成5 μm切片，苏木精-伊红染色。依据文献〔6〕在光学显微镜下观察结肠黏膜的完整性、黏膜下炎性细胞浸润的程度及肠壁腺体结构的改变等，对肠道炎症组织学损伤进行评分，评分标准见表2。

表2 结肠组织学损伤评分标准

1.6 促炎因子和抗炎因子检测 取出冷冻保存的结肠标本，与0.9%氯化钠溶液按1∶9比例混合，于自制冰床上充分研磨，直至匀浆液中仅有少量结缔组织。将匀浆液移至离心管中，4℃下3 000 r/min离心30 min，离心半径15 cm。取上清液，利用细胞因子特异性试剂盒进行酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA），按照试剂盒使用说明书中步骤进行操作，检测结肠组织匀浆中促炎细胞因子IL-6，IL-17，TNF-α以及抗炎细胞因子IL-10的水平。

1.7 统计分析 所有统计分析均使用SPSS 25.0软件进行，结果以（±s）表示。多组间数据比较采用单因素方差分析，多组间两两比较根据方差是否齐性采用LSD法或Tamhane法，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组大鼠体质量变化百分数和DAI评分 第7天，停止饮用DSS溶液后，进入UC缓解期。对照组大鼠体质量稳定增加，UC组、UC+酒精组大鼠体质量均从第4天开始降低；与对照组比较，除第1天外，UC组、UC+酒精组、UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠体质量变化百分数均降低，DAI评分增加，差异有统计学意义（P<0.05）。从第7天开始，接受DSS和酒精联合处理的大鼠（UC+酒精组），与仅饮用DSS的大鼠（UC组）相比，体质量下降更明显，DAI评分进一步增加，差异有统计学意义（P<0.01）。与UC+酒精组比较，使用水溶性蜂胶（UC+酒精+蜂胶组）和美沙拉嗪（UC+酒精+美沙拉嗪组）预处理的大鼠，体质量变化百分数明显减少，且DAI评分降低，差异有统计学意义（P<0.05）。提示DSS成功建立UC大鼠模型，酒精可加重UC发作，加剧结肠炎症，水溶性蜂胶和美沙拉嗪可缓解酒精加重的UC发作，减轻结肠炎症。见表3~4。

表3 各组大鼠体质量变化百分数（%，±s）

表3 各组大鼠体质量变化百分数（%，±s）

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与UC组比较## P<0.01；与UC+酒精组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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表4 各组大鼠DAI评分（±s）

表4 各组大鼠DAI评分（±s）

注：与对照组比较*P<0.05，**P<0.01；与UC组比较## P<0.01；与UC+酒精组比较ΔP<0.05，ΔΔP<0.01。

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2.2各组大鼠结肠长度、结肠质量、结肠质量指数和HS与对照组比较，UC组、UC+酒精组、UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠结肠长度明显缩短（P<0.01），结肠质量（除UC+酒精+美沙拉嗪组外）均明显升高（P<0.01），结肠质量指数均明显升高（P<0.01），HS均明显升高（P<0.01）。与UC组比较，UC+酒精组大鼠结肠长度进一步缩短（P<0.01），结肠质量、结肠质量指数及HS均进一步升高（P<0.01）。与UC+酒精组比较，UC+酒精+蜂胶组和UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠的结肠质量、结肠质量指数和HS均降低（P<0.05），结肠长度增加（P<0.05）。见图1。结果提示“酗酒”模式后，酒精加重结肠损伤，UC症状恶化，水溶性蜂胶和美沙拉嗪对酒精加重的UC发作有一定治疗效果。

图1 各组大鼠结肠长度、结肠质量、结肠质量指数和HS

2.3 各组大鼠结肠组织匀浆中IL-6，IL-10、IL-17和TNF-α含量 结果显示，与对照组比较，UC组、UC+酒精组、UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠结肠组织中TNF-α和IL-17含量均显著升高（P<0.01），IL-6含量（除UC+酒精+美沙拉嗪组外）均明显升高（P<0.01），IL-10含量显著降低（P<0.01）。与UC组比较，UC+酒精组大鼠结肠组织中IL-6，TNF-α和IL-17含量升高（P<0.01），IL-10含量降低（P<0.01）。与UC+酒精组比较，UC+酒精+蜂胶组、UC+酒精+美沙拉嗪组大鼠结肠组织中IL-6，TNF-α和IL-17含量降低（P<0.01），IL-10含量升高（P<0.01）。见图2。

图2 各组大鼠结肠组织匀浆中IL-6、IL-10、IL-17和TNF-α含量

3 讨论

某些食物可以诱发或加重UC症状，这些食物在文献中通常被称为“触发食物”〔7〕。其中，酒精与UC的发展和恶化有关，临床数据也证实UC复发风险增加与高浓度酒精摄入相关〔8〕。但目前很少有研究描述酒精对UC发作的影响。因此，本研究采用DSS诱导大鼠UC模型，随后让大鼠接受“酗酒”模式，探究酒精是否加重UC症状。美沙拉嗪是一种治疗UC的常用药物，可显著抑制结肠炎症，但其副作用较多，寻找新的替代药物尤为重要。蜂胶是一种黏性天然化合物，是一种天然的抗生素，已被广泛用作食品补充剂，自古埃及时代以来，它一直被用于治疗各种炎症性疾病。蜂胶含有400多种化学物质，包括萜类、多酚、类黄酮等，具有多种生物学功能，包括抗炎和免疫调节等〔9〕。本研究对水溶性蜂胶缓解酒精加重UC发作的作用机制进行了初步探索。

DSS诱导的结肠炎是研究UC发作的成熟模型。该模型表现出许多与人类UC相似的症状，如：体质量减轻、结肠缩短、腹痛、腹泻、便血、肠黏膜溃疡和促炎细胞因子产生增加等。文献〔10〕中使用3%~5% DSS溶液诱导大鼠UC模型，本实验中为区别单独使用DSS及DSS和酒精联合使用导致结肠炎症损伤的微小差别，使用4%的DSS溶液，使用DSS处理的SD大鼠（UC组）表现出体质量减轻、DAI评分升高，结肠长度缩短，结肠质量指数升高及HS升高等一系列UC症状，表明UC模型制备成功。与UC组相比，UC+酒精组大鼠体质量及结肠长度进一步降低，DAI评分、结肠质量指数、HS进一步升高。结果表明，在DSS诱导大鼠结肠炎后，再经历“酗酒”模式，可明显加重结肠炎症。Bishehsari等〔11〕认为酒精可能通过多种途径诱发肠道炎症，其中肠黏膜免疫系统破坏发挥重要作用，且在活动性肠道炎症情况下，继续饮酒会加重疾病活动。

贯穿整个胃肠道的促炎和抗炎细胞因子之间的微妙平衡对于健康的肠黏膜屏障功能和稳态至关重要。免疫耐受性的破坏是UC的一个重要标志〔12〕。大量证据表明，UC主要是由于固有层T淋巴细胞的激活不当所致，当幼稚T淋巴细胞与抗原呈递细胞（antigen presenting cells，APC）接触时，它们有可能被激活并分化为T淋巴细胞亚群，包括辅助性T淋巴（helper T，Th）1、Th2、Th17细胞和调节性T（regulatory T，Treg）细胞。近期发现Th17细胞与许多免疫炎症性疾病有关，并且在UC进展中的重要性已经被证实；Treg细胞具有免疫调节功能，促进免疫耐受，具有抗炎作用，在抑制免疫反应和维持免疫耐受方面发挥重要作用。故Th17细胞的过度反应和Treg细胞的功能不足与UC发作有关〔13〕。

IL-17是一种由Th17细胞产生的促炎细胞因子，它可以激活信号转导和转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3），从而刺激强烈的慢性免疫炎症反应，它在肠道炎症部位充当促炎反应的触发器〔14〕，在炎症反应期间招募T淋巴细胞到固有层，导致肠道免疫系统过度激活，触发了一系列的细胞内事件，导致细胞凋亡、细胞浸润和肠黏膜结构完整性和功能丧失，从而促进肠道炎症，而抑制Th17可以有效减少急性结肠炎的发展。由于Th17细胞在肠道炎症中起着关键作用，因此有人提出促炎细胞因子IL-17可能是调节肠道炎症反应的治疗靶点。本研究发现，与对照组相比，UC组大鼠结肠组织中IL-17水平升高；与UC组相比，UC+酒精组大鼠结肠组织中IL-17水平进一步升高；而与UC+酒精组相比，UC+酒精+蜂胶组大鼠结肠组织中IL-17水平降低，说明在活动性炎症疾病期间，摄入酒精可提高促炎细胞因子IL-17水平，加剧肠道炎症；水溶性蜂胶靶点Th17细胞，降低IL-17水平，发挥抗炎作用，改善酒精加重的UC发作，蜂胶的抗炎特性主要是由于它的类黄酮成分。Khosravi等〔15〕报道，烟曲霉分生孢子是最常见的室内真菌过敏原，可增加促炎细胞因子IL-17的释放诱导过敏性哮喘，蜂胶提取物可降低IL-17的水平，有效缓解哮喘发作。巴西蜂胶乙醇提取物对胶原诱导性关节炎（collagen-induced arthritis，CIA）发病机制的保护作用与抑制CIA小鼠中IL-17水平有关〔16〕。

幼稚T淋巴细胞向Th17细胞分化受到高浓度促炎细胞因子IL-6的调节，被IL-6激活的STAT3是参与Th17分化的关键信号分子，Th17细胞可分泌促炎细胞因子，如IL-17和TNF-α，在肠道炎症中发挥致病作用。我们同样检测了各组结肠组织中IL-6和TNF-α的水平，结果表明UC组和UC+酒精组IL-6、TNF-α的发生趋势与IL-17一致，促炎细胞因子的过量产生可导致活动性炎症〔17〕。与UC+酒精组相比，UC+酒精+蜂胶组的IL-6、TNF-α水平下降趋势与IL-17也一致，说明蜂胶可抑制促炎细胞因子IL-6、TNF-α的产生，这与文献报道蜂胶在体外抑制IL-6诱导的Th17细胞分化，抑制IL-6诱导的信号转导和STAT3的磷酸化，在炎症免疫性疾病中发挥抗炎作用一致〔18〕。说明蜂胶对Th17细胞分化的抑制作用有助于控制UC中的细胞因子稳态不平衡，从而发挥抗炎作用。

与对照组相比，UC组大鼠结肠组织中IL-10水平降低；与UC组相比，UC+酒精组大鼠结肠组织中IL-10水平进一步降低。IL-10是一种有效的抗炎细胞因子，由Treg细胞分泌。Treg细胞是T细胞的一个特殊子集，具有免疫调节功能，能促进免疫耐受和抗炎，在抑制免疫反应和维持免疫耐受方面发挥重要作用〔19〕。文献〔20〕报道IL-10的缺失会导致肠道炎症，而缺乏IL-10受体的Treg细胞更容易发生结肠炎。Treg细胞通过降低Th17相关细胞因子的表达预防肠道炎症。IL-10还可以直接抑制CD4+Th的促炎细胞因子的表达，并通过APC抑制趋化因子的表达〔21〕。IL-10缺陷小鼠发生自发性IBD，其特征是存在由淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞组成的炎症浸润〔19〕。故推测在活动性结肠炎期间，摄入大量酒精，抑制Treg细胞分泌抗炎细胞因子IL-10，加重UC期结肠炎症。与UC+酒精组大鼠比较，UC+酒精+蜂胶组大鼠结肠组织中IL-10水平升高，推测蜂胶可通过提高抗炎细胞因子IL-10水平，在UC发作期间对结肠黏膜起保护作用。有文献〔22〕报道，蜂胶可通过Jak/Stat途径下调核因子-кB途径，进而降低TNF-α、IL-8、IL-12、单核细胞趋化蛋白1、细胞间黏附分子1等的水平，调节先天和适应性免疫反应，发挥抗炎作用。

综上所述，酒精加重UC的发作，是导致UC症状持续存在的潜在因素。水溶性蜂胶可以通过降低结肠组织中促炎细胞因子IL-6、IL-17、TNF-α水平，提高抗炎细胞因子IL-10的水平，控制UC中细胞因子稳态的不平衡，从而缓解酒精加重的UC发作。