HPLC法同时测定祛斑养颜胶囊中7种成分含量

孔艳娥

（曲靖医学高等专科学校，云南曲靖 655011）

祛斑养颜胶囊为曲靖市第一人民医院的院内制剂，具有疏肝理气、散郁调经、活血、化瘀、祛斑的功效，临床用于治疗面部黄褐斑、色素沉着，经过20多年临床实践，疗效确切。其组方为柴胡（醋炙）、白术（麸炒）、生姜、丹参、桃仁、青蒿、川芎、当归（蒸）、白芍（酒炙）、栀子（炒）、香附、牡丹皮、薄荷、藏红花。丹参具有活血祛瘀、通经止痛、清心止烦、凉血消痈的功效，其一类主要有效成分是以没食子酸、丹参素钠和丹酚酸B为代表的水溶性成分〔1〕。川芎具有活血行气、祛风止痛的功效，其主要有效成分是以阿魏酸为代表的有机酸类成分〔2〕。当归具有补血活血、调经止痛、润肠通便的功效，其主要有效成分是以阿魏酸为代表的水溶性有机酸类成分〔3〕。栀子具有泻火止烦、清热利湿、凉血解毒的功效，其主要化学成分是以栀子苷为代表的环烯醚萜类成分〔4〕。白芍具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效，其主要化学成分是以芍药内酯苷和芍药苷为代表的单萜类成分〔5〕。在现行质量标准中，仅对川芎和当归进行定性鉴别，没有定量相关标准，中药复方制剂的药效大多是多成分协同作用的结果，为更好地提升其质量的可控性，确保临床疗效，本文建立了HPLC法同时测定祛斑养颜胶囊中没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、丹酚酸B、阿魏酸7种成分含量的方法，为其质量标准提升提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-20AT型高效液相色谱仪（配LC-20AT输液泵、SIL-20A自动进样器、CBM-20A控制器、SPD-20A紫外检测器、CTO-10AS vp柱温箱、DGU-20A5脱 气 机、LCsolution色 谱 工 作 站，Shimadzu公司）；MS205DU型电子天平（梅特勒-托利多仪器有限公司）；岛津UV-2401PC型紫外可见分光光度计（Shimadzu公司）；AS10200BDT超声波清洗机（天津奥特赛恩斯仪器有限公司）；电热恒温水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

1.2 试剂与药物 没食子酸对照品（批号：110831-201605，含量：90.8%）、丹参素钠对照品（批号：110855-201613，含量：98.8%）、栀子苷对照品（批号：110749-201115，含量：99.7%）、芍药内酯苷对照品（批号：19121705，含量：99.28%）、芍药苷对照品（批号：110736-201640，含量：95.2%）、阿魏酸对照品（批号：110773-201614，含量：99.0%）、丹酚酸B对照品（批号：111562-201615，含量：96.2%），除芍药内酯苷对照品购自成都普菲德生物科技有限公司外，其余对照品均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（Merck KGaA公司，色谱纯）；蒸馏水；其余试剂均为分析纯；祛斑养颜胶囊（批号：20160513、20160826、20161129、20170104，规格：0.4 g/粒）由曲靖市第一人民医院制剂室提供。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 色谱柱：依利特C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；柱温：25℃；流动相：0.1%磷酸溶液（A）-乙腈（B）；梯度洗脱（0～35 min，4%→18% B；35～55 min，18%→33% B；55～65 min，4% B）；流速：1.0mL/min；检测波长：232 nm；进样量：10 μL。

2.2 溶液制备

2.2.1 对照品溶液 分别精密称取没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B对照品适量，加70%甲醇制成每1 mL分别含上述对照品0.159 9、0.189 9、0.831 9、0.338 6、0.970 3、0.080 6、0.529 1 mg的混合对照品储备液。精密量取上述对照品储备液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得对照品溶液。

2.2.2 供试品溶液 取祛斑养颜胶囊20粒，取其内容物，研细，混匀，称取约1.0 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 mL，称定重量，置水浴回流40 min，放冷，用70%甲醇补足减失的重量，摇匀，静置，取上清液滤过，即得供试品溶液。

2.2.3 阴性供试品溶液 按处方及工艺，分别制得不含丹参、栀子（炒）、白芍（酒炙）、川芎和当归（蒸）的阴性供试品，按“2.2.2”项下方法制成阴性供试品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 线性关系考察 精密吸取“2.2.1”项下的对照品储备液0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00 mL，分别置于10 mL容量瓶中，加70%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，即得。分别进样10 μL，记录峰面积。以对照品质量浓度（X）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，得回归方程，结果见表1。没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B在各自的线性范围内线性关系良好。

表1 7种成分的线性关系

2.3.2 专属性试验 分别吸取“2.2”项下的3种溶液，按“2.1”项下色谱条件测定。结果，阴性供试品在与对照品和供试品色谱峰保留时间相应位置上，没有相应的色谱峰，表明阴性供试品不干扰测定，色谱图见图1。

图1 高效液相色谱图

2.3.3 精密度试验 精密吸取“2.2.2”项下的供试品（批号：20160513）溶液10 μL，连续进样6次，记录峰面积。结果，没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的RSD分别为0.62%、0.49%、0.51%、0.67%、0.71%、0.52%、0.48%。表明仪器精密度良好。

2.3.4 重复性试验 取同一批供试品（批号：20160513）6份，按“2.2.2”项下制备，测得没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B的含量均值分别为0.435 5、0.843 5、2.977 0、1.428 2、4.080 8、0.326 0、2.660 0 mg/g，其含量的RSD分别为0.78%、0.60%、0.83%、0.74%、0.65%、0.92%、0.57%，表明试验重复性良好。

2.3.5 稳定性试验 取同一批供试品（批号：20160513）溶液，按“2.2.2”项下制备，分别在0、4、8、16、24、36 h时进样10 μL，记录峰面积。结果，没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B峰面积的RSD分别为0.69%、1.05%、0.62%、0.87%、0.96%、1.21%、0.74%，表明供试品36 h内稳定性良好。

2.3.6加样回收率试验 取已知含量的祛斑养颜胶囊（批号：20160513）6份，每份约0.5 g，精密称定，加入“2.2.1”项下的对照品储备液2.5 mL，再加入70%甲醇47.5 mL，按“2.2.2”项下操作。测得各成分加样回收率见表2。7种成分平均加样回收率均不低于98.54%，RSD均不高于0.90%，表明试验方法可行，符合定量分析要求。

表2 各成分加样回收率试验结果（n＝6）

2.4 供试品测定结果 取3批供试品，按“2.2.2”项 下的方法制备供试品溶液，测定含量。见表3。

表3 供试品含量测定结果（mg/粒，n＝3）

3 讨论

3.1 检测指标的选择 《中华人民共和国药典》（2015版）〔6〕选择栀子苷为栀子（炒）、芍药苷为白芍（酒炙）、阿魏酸为川芎和当归（蒸）、丹酚酸B为丹参的水溶性成分质量控制指标，由于中药复方制剂的复杂性，并考虑中药复方制剂的药效大多是多成分协同作用的结果，本文参考《中华人民共和国药典》〔6〕并结合药材有效成分情况，选择没食子酸、丹参素钠、丹酚酸B、阿魏酸、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷为检测指标。

3.2 检测波长的选择 分别称取没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、阿魏酸、丹酚酸B对照品适量，用70%甲醇制成适宜浓度的对照品溶液，在200~550 nm波长范围内进行扫描，结果显示，没食子酸在220 nm和273 nm、丹参素钠在212 nm和282 nm、栀子苷在236 nm、芍药内酯苷和芍药苷在230 nm、阿魏酸在232 nm和320 nm、丹酚酸B在255 nm和284 nm波长处有最大吸收。根据扫描图谱吸收度大小情况和定量测定要求，同时兼顾7种成分用一个波长测定，最终确定了232 nm的检测波长。

3.3 提取方法的选择 参考《中华人民共和国药典》（2015版）〔6〕及文献〔7-15〕，对提取溶剂（甲醇和乙醇）、溶剂浓度（50%、60%、70%、80%、100%）、提取方法（超声和回流）、提取时间（30、40、50 min），进行正交试验，发现用70%甲醇回流提取40 min的方法对7个待测成分都能提取完全，提取率高，特别是芍药苷用此方法提取时，测定得到的含量最高。

3.4 流动相的选择 参考《中华人民共和国药典》（2015版）〔6〕及文献〔7-13〕，试验了0.1%磷酸溶液-乙腈、0.1%磷酸溶液-甲醇系统。使用0.1%磷酸溶液-甲醇系统时，栀子苷和芍药苷与其附近杂质峰均分离不佳，且阿魏酸峰形不好；使用0.1%磷酸溶液-乙腈系统时，阿魏酸峰形较好，经反复调整流动相比例和梯度，当为本试验流动相方法时，各待测成分分离度和峰形均能达到良好效果。因此确定0.1%磷酸溶液-乙腈系统为本试验的流动相。

本实验采用HPLC法同时测定祛斑养颜胶囊中没食子酸、丹参素钠、栀子苷、芍药内酯苷、芍药苷、丹酚酸B、阿魏酸7种成分的含量，该方法简便可靠，结果准确，重复性好，可为该制剂的质量控制标准的提升提供参考。