血清氧化应激/抗氧化产物水平与脑梗死患者I型复杂性局部疼痛综合征严重程度的相关性研究

张真真，尹莲君，许望纯，杨加顺，陈俊琦，赵远闯

复杂区域疼痛综合征（complex regional pain syndrome,CRPS）是一种慢性神经系统疾病，可导致严重的功能躯体障碍。其临床特征为自发性疼痛、痛觉过敏、肿胀、血管舒缩不稳定、运动功能受损和自主神经异常[1-2]。CRPS通常发生在一些伤害性事件后，如创伤、手术、心肌梗死或脑卒中等，少数无特殊病因[3-4]。

CRPS可分为两种类型：I型，发生时没有明确的症状神经损伤;II型，患者存在可确定的神经损伤[5]。虽然CRPS I型的发病率通常低于II型，但CRPS I型在中风患者中更为常见[6]。CRPSI是一种致残性神经性疼痛综合征，其特征为自发或外界刺激诱发疼痛、水肿、血管舒缩和发汗异常、运动功能障碍和营养变化[7]，然而CRPSI并没有外周神经损伤的明确证据。目前有研究表明炎症、交感神经活性改变、缺血、再灌注损伤和中枢敏化等机制参与，但CRPSI的潜在机制尚不清楚[8]。

氧化应激是由自由基在体内产生的一种负面作用,是指体内氧化与抗氧化作用失衡的一种状态，导致中性粒细胞炎性浸润，蛋白酶分泌增加，产生大量氧化中间产物。对组织损伤、神经源性炎症、缺血和再灌注损伤的过度炎症反应都会导致自由基的过度产生[9]。而自由基可进一步增加血管通透性，释放P物质等神经肽，增强炎症反应并导致进一步的组织损伤[10]。然而，自由基在CRPSI发病中的作用未有研究。

本研究的科学假设为：CRPSI患者体内自由基的产生增加，而使用抗氧化剂和自由基清除剂作为CRPSI有效治疗方法，且血清氧化应激产物浓度的变化可作为一种诊断监测手段。因此本研究拟测量脑梗死CRPSI患者、非CRPSI患者和健康志愿者的血清脂质过氧化产物-丙二醛（Malonaldehyde,MDA）和抗氧化剂超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）的表达，并探讨其与CRPSI患者症状严重程度的相关性。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取2019年8月-2021年8月在南方医科大学第三附属医院住院并诊断为脑梗死后CRPSI的患者75例及非CRPS1患者80例纳入本次研究，同时入选同期来自于我院的常规健康体检者78例。分为三组，即脑梗死后CRPSI患者组(n=75)，脑梗死后非CRPSI患者组(n=80)以及健康对照组(n=78)。所有患者在性别、年龄和BMI中无统计学差异。脑梗死诊断符合《中国急性缺血性脑卒中诊治指南2018》[11]相关诊断,且经脑CT或MRI证实。患者均于脑梗死发病后的1～3个月内发生。排除脑出血、脑肿瘤、癫痫、颅内感染、帕金森病等神经系统疾病者；肩周炎、肩关节脱位、腕管综合征、视力障碍者；伴有严重心、肝、肾等脏器功能障碍者。CRPSI的诊断参考Bruehl标准[12]以及下列评估方式：①一般情况资料:出现疼痛的情况和时间点；②患肢皮肤、毛发或指甲的温度及颜色变化、发汗异常、肿胀及运动功能障碍等；③VAS评分；④运动能力和运动范围情况；⑤是否存在痛觉异常和痛觉过敏；⑥表面温度计测量皮肤温度的情况。有任何其他无关医疗问题的患者都被排除在研究之外。研究方案经我院医学伦理委员会批准(伦理编号：20190012)，并获得每位参与者的书面知情同意书。

1.2 方法

1.2.1 观察指标(1)采用VAS评分量表对24 h内患者所感受到的最大疼痛强度进行测量，每位患者用“0”（无痛）到“10”cm（可想象的最严重疼痛）的活动来表示他们感知的静息痛、夜间痛和疼痛强度[13]。(2)水肿分级参考标诊断[14]中的内容：肢体无水肿为0度；有水肿，但皮纹尚清晰为Ⅰ度；有明显水肿，皮纹不清晰为Ⅱ度；皮纹消失，可见张力性水疱为Ⅲ度。(3)Constant-Murley肩关节功能评分、Carroll手功能评分、Cooney腕关节评分评估患者肩关节、腕关节、手功能情况,其中Constant-Murley肩关节功能评分包括疼痛、日常生活活动、主动活动范围、肌力4个部分,评分范围为0～100分，分值越高表示肩关节功能越好[15]。Carroll手功能评分包括抓握、握、侧捏、捏、放置、旋前或旋后6项内容,评分范围为0～38分,分值越高表示手功能越好[15]；Cooney腕关节评分包括疼痛、功能、活动度、背伸/掌屈、握力与正常一侧比，评分范围为0～100分,分值越高表示腕关节功能越好[15]。(4)肢运动功能情况,本研究选择上肢功能作为研究重点，采用脑卒中患者专用的Brunnstrom运动功能分级标准进行评定，具体分级标准：Ⅰ级为无任何运动；II级为仅出现协同运动模式；III级为可随意发起协同运动；IV级为共同运动模式打破,开始出现分离运动；V级为肌张力逐渐恢复,有分离精细运动；VI级为运动接近正常水平[16]。

1.2.2 实验室检测在早晨禁食至少1 h后收集血清样本。对于血清样品，将21号套管插入未患肢的肘前静脉中。抽取10 mL血液，立即转移到装有EDTA的试管中，该试管在8℃下保持1 h，然后在4℃下以3000 rpm离心7 min。将血清转移到聚丙烯试管中，-20°C下储存。使用Bioxytech S.A.(Cedex法国）公司的GSH-400和SOD-525方法和分析条件，通过分光光度计（Bio Rad，CA，美国）测量血清SOD水平，使用Randox-RANSOD酶试剂盒和自动分析仪在505 nm和37℃下测量SOD活性。SOD试剂盒批内变异系数为2.5%，批间变异系数为4.7%。使用硫代巴比妥酸反应物法测定血清MDA水平[17]。将样品放置在96孔板中，并使用微孔板分光光度计读数器（Bio Rad，CA，美国）在535 nm处读数。MDA试剂盒批内变异系数为1.3%，批间变异系数为3.1%。

1.3 统计学处理所得数据应用Graphpad8.0 prism统计软件进行分析。采用Shapiro-Wilktest进行正太分布检验。计量资料呈正态分布，以均数±标准差（）表示,两组资料比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析(One-way ANOVA)；计数资料以率或者构成比表示,数据处理采用χ2检验,等级资料比较采用非参数的秩和检验,采用Spearman或Pearson检验进行相关性分析，采用Logistic回归分析用于确定血清MDA和SOD是否分别是CRPSI患者VAS评分的独立预测因子，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料脑卒中后CRPSI患者，非CRPSI患者和健康对照组在年龄，性别以及BMI上无统计学差异（P＞0.05，表1）。CRPSI患者Carroll手功能评分和Cooney腕关节评分显著低于非CRPSI患者(Carroll手功能评分:18.9±5.3vs 20.6±4.4,t=1.564,P=0.042;Cooney腕关节评分:70.0±6.6 vs 72.3±5.8,t=1.476,P=0.038)。血清MDA在脑卒中伴有CRPSI患者中水平显著高于无CRPSI患者及健康志愿者(2.78±0.62 nmol/mL vs 2.00±0.52 nmol/mL，t=8.437,P＜0.001；2.78±0.62 nmol/mL vs 1.70±0.49 nmol/ml,t=10.122，P＜0.001)（图1A）。而SOD水平在CRPSI患者中水平则显著低于CRPSI患者及健康志愿者(82.76±21.80 U/mL vs 153.1±44.73 U/mL,t=12.31，P＜0.001；82.76±21.80 U/mL vs 182.00±63.18 U/mL,t=15.15，P＜0.001)（图1B）。

表1 脑卒中后CRPSI患者，非CRPSI患者和健康对照组的一般资料比较

图1 血清MDA和SOD水平在CRPSI患者、非CRPSI及健康对照组中的比较

2.2 血清MDA和SOD水平与疼痛的相关性血清MDA水平在重度疼痛的CPRSI患者中高于轻中度疼痛的患者(3.23±0.49 nmol/mL vs 2.57±0.56 nmol/mL，t=4.973，P＜0.001)（图2A），而血清SOD水平在重度疼痛的CPRSI患者中低于轻中度疼痛的患者(72.16±20.17 U/mL vs 87.47±21.10 U/mL，t=2.857，P=0.005)（图2B）。CPRSI患 者 血 清MDA水 平与VAS评 分 呈 正 相 关 性(r=0.610，P＜0.001)（图2C）,而血清SOD水平与VAS评分呈显著负相关性(r=-0.342，P=0.005)（图2D）。ROC曲线分析表明CPRSI患者血清MDA水平的升高(AUC=0.892，P＜0.001)（图2E）以及SOD水平的降低(AUC=0.701,P=0.005)(图2F)对CPRSI患者疼痛评定均有较好的诊断价值。此外Logistic回归分析表明血清MDA和SOD水平均可以作为预测CRPSI患者疼痛的独立因子（表2）。

表2 Logistic回归分析

图2 血清MDA和SOD水平与疼痛的相关性

2.3 血清MDA和SOD水平与肩、手、腕功能的相关性血清MDA水平与Constant-Murley评分(r=-0.626，P＜0.001)（图3A）、Carroll评分(r=-0.521，P＜0.005)（图3B）和Cooney评分(P=-0.322，P=0.005)（图3C）均呈负相关，而血清SOD水平与Constant-Murley评分(r=0.447，P＜0.001)（图3D）和Carroll评分(r=0.465，P＜0.001)（图3E）呈正相关，但与Cooney评分的相关性无统计学意义(r=0.128,P=0.285)（图3F）。A.血清MDA水平与Costant-Murley评分的相关性；B.血清MDA水平与Carroll评分的相关性；C.血清MDA水平与Cooney评分的相关性；D.血清MDA水平与Carroll评分的相关性；E.血清MDA水平与Carroll评分的相关性F.血清MDA水平与Cooney评分的相关性

图3 血清MDA和SOD水平与肩、手、腕功能的相关性

2.4 血清MDA和SOD水平在不同肢体水肿分度和Brunnstrom分级中的表达I度水肿患者30例，II度水肿患者28例，III度水肿患者17例。MDA水平在III度水肿患者高于于II度水肿患者(3.23±0.53 mmol/mL vs 2.82±0.61mmol/mL，t=2.320，P=0.025)，而在II度水肿患者高于I度水肿患者(2.82±0.61mmol/mL vs 2.48±0.52 mmol/mL，t=2.269，P=0.027)（图4A）。另一方面，SOD水平在III度水肿患者低于II度水肿患者(63.04±15.66 U/mL vs81.93±21.08 U/mL，t=3.192，P=0.003)，而在II度水肿患者低I度水肿患者(81.93±21.08 U/mL vs94.71±16.93 U/mL，t=2.553，P=0.013)（图4B）。

CRPSI患 者 中Brunnstrom 1/2级 患 者24例，Brunnstrom 3级患者26例，Brunnstrom 3级患者25例。CRPSI Brunnstrom 4级患者血清MDA低于3级患者(2.42±0.54 mmol/mL vs 2.78±0.62 mmol/mL，t=2.186，P=0.033)，Brunnstrom 3级患者血清MDA水平低于1/2级患者(2.78±0.62 mol/mL vs 3.13±0.50 mol/mL，t=2.182，P=0.033)（图4C）。而CRPSI患者血清SOD水平Brunnstrom 4级虽然高于3级，但未达到统计学差异(88.99±20.90 U/mL vs 86.83±22.40 U/mL，t=0.356,P=0.723)，Brunnstrom 3级患者血清SOD水平高于1/2级患者(86.83±22.40 U/mL vs 71.87±18.51 U/mL，t=2.561，P=0.014)（图4D）。

图4 血清MDA和SOD水平在不同肢体水肿分度和Brunnstrom分级中的表达

4 讨论

脑梗死是导致中老年人群致残率增加、日常生活能力缺失的重要原因之一。CRPS是脑卒中常见的并发症之一，表现为患侧肩部、腕、手等部位的疼痛、水肿、营养障碍、肌肉萎缩和肌力下降，且伴有不同程度的肢体功能受限[18]。反复持续的肢体疼痛、肿胀使患者遭受极大的身心折磨，严重影响患者肢体功能的恢复。脑卒中发生CRPS的病理生理机可能为脑缺氧缺血后导致大脑皮质结构重组，并诱导外周及中枢系统感觉过敏，异常神经冲动逆向传导入外周神经末梢后释放致痛介质,导致局部疼痛、血管扩张和毛细管通透性增加而诱发肢体水肿[19]。CRPS通常发生于脑卒中发病的1～3个月内，病程可持续数周或数月，其疼痛常呈顽固性，治疗效果较差。

迄今为止还没有针对CRPSI的特异性具体实验室检查项目；目前CRPSI的诊断主要基于对体征和症状的临床观察以及某些特定的检查方法：WHO三级镇痛阶梯、定量感觉测试(QST)、自主测试（包括对出汗异常的定量发汗轴突反射测试(QSART)、冷加压试验结合热成像观察血管收缩反应以及激光多普勒血流测定法监测血管舒缩控制[20]。

本研究表明CRPSI患者中的氧化应激及其变化可能是CRPSI的发病机制。既往研究表明除了外周和中枢神经、自主神经缺血[21]，炎症也被认为在参与CRPS的发病机制有关[22]。实验研究和临床研究数据均表明，组织损伤、神经源性炎症和缺血再灌注损伤都可能导致自由基的过度产生[23]。而自由基可以增加血管渗透性，释放神经肽(如P物质)，增强炎症并导致进一步的组织损伤[24]。此外，许多临床试验表明，自由基清除剂维生素C和二甲基亚砜(DMSO)等可以减轻CRPSI患者的症状和体征[25-26]。

本研究发现血清MDA与SOD分别与VAS评分呈正相关和负相关，血清MDA水平与Constant-Murley评分、Cooney评分和Carroll评分分别负相关性，而血清SOD水平与Constant-Murley评分和Carroll评分正相关性。表明氧化应激水平约高，CRPSI患者疾病程度就约严重，功能程度也越差。根据本文结果我们推测，在CRPSI中出现疼痛以及其它症状至少有部分是由自由基导致的，因为各种自由基对神经元的损伤可导致神经病理痛。MDA的升高与神经病理痛和自由基诱导的损伤相关的机制密切联系。MDA水平的增加与神经组织中抗氧化防御酶的减少有关[27]。细胞脂膜中不饱和脂肪酸的结构破坏引起组织损伤是活性氧的产生而造成损害。而MDA在大鼠酒精性神经病变发展过程中氧化应激的产生和维持中发挥了重要作用[27]。而另一方面，SOD被证明可有效缓解因自由基损害而产生的神经病理痛[28]。

本研究仍然存在一些局限性。例如，测定其他抗氧化剂和氧化剂状态的化合物可能会获得其他更多的信息。其次，其他与疾病无关的潜在混杂因素（如饮食）可能影响血清MDA或SOD的水平。最后血清SOD的降低和MDA水平的增高的与CRPSI患者症状之间的关联并不能决定其因果关系，因此使用抗氧化药物是否能改善脑梗死后CRPSI患者的症状需进行进一步的临床研究。

总之，血清氧化应激/抗氧化产物可能参与了CRPSI的病理生理进程，这在血清中可以得到反映，对CRPSI患者的诊断和治疗可能具有重要意义。