间歇式超声辅助酶法提取葡萄皮渣白藜芦醇工艺优化

张 勤 田子明 王金柱

(焦作职工医学院基础医学部，河南 焦作 454000)

白藜芦醇属于非黄酮类多酚有机化合物，是植物受到刺激时产生的一种抗毒素，主要存在于葡萄、大豆、樱桃、石榴和一些坚果的果皮中[1-2]，具有祛痰、止咳、平喘、驱风、健胃、解热、镇痛、抗菌、消炎等作用。同时，在抗肿瘤、抗氧化、抗菌等方面具有独特的优势，对人体健康益处明显[3-5]，被认为是较有前景的治疗心血管疾病、抗癌、防衰老的活性物质。

许多学者对白藜芦醇的提取开展了相关研究，在酶法、超声波辅助以及超声波辅助酶法提取方面均有涉及：张华等[6]使用纤维素酶和果胶酶共同酶解提取蓝莓皮渣中的白藜芦醇，发现最优提取条件为料液比(m蓝莓皮渣∶V乙醇)1∶20 (g/mL)、复合酶配比(m纤维素酶∶m果胶酶)1∶5、酶解温度54.62 ℃、酶解时间1 h、pH 5.38，白藜芦醇最高得率为236.424 mg/kg；崔霖等[7]对超声波辅助乙醇回流法提取虎杖白藜芦醇的工艺进行优化，发现在乙醇质量分数80%、原料与溶剂配比(m原料∶m溶剂)1∶28、超声功率120 W的条件下浸提60 min，白藜芦醇得率达到1.36%。由于超声波的空化、扰动和搅拌等多级效应可提高提取效率[8-9]；而酶法提取则较为温和，可有效保持天然产物的基本结构[10-11]，但提取时间长、易氧化。因此，有学者开展了超声波辅助酶法提取白藜芦醇的研究：汪开拓等[12]对超声波辅助乙醇提取葡萄皮渣中白藜芦醇的工艺进行了优化，当乙醇体积分数为50%、液料比(V乙醇∶m葡萄皮渣)为12∶1 (mL/g)、提取温度为35.6 ℃、提取时间为34.8 min和超声波功率为231 W时，白藜芦醇的得率最高为48.72 μg/g·FW。同时，Zhou等[13]使用超声波辅助虎杖苷-β-葡萄糖苷酶(PBG)在乙醇/硫酸铵体系中进行酶解来提取白藜芦醇，最大得率较单独使用酶法有大幅度提高，达到了10.7 mg/g。此外，黄兆翔等[14]对超声波辅助酶法提取花生红衣白藜芦醇工艺进行了优化，当乙醇体积分数为80%、料液比(m花生红衣∶V乙醇)为1∶25 (g/mL)、超声时间为30 min、提取温度为50 ℃时，白藜芦醇的提取量为(0.854±0.025) mg/100 g。

由于长时间持续使用超声波会导致分子运动速度加剧、温度升高，可能破坏提取物的结构与活性[15]。间歇式超声波可在一定程度上改善这种状况[16]，但暂未见用辅助酶法提取葡萄皮渣白藜芦醇的报道。研究以葡萄皮渣为原料，将超声波间歇处理与酶解提取相结合来提取白藜芦醇。通过响应面法优化提取工艺，并对葡萄皮渣白藜芦醇进行抗氧化性能分析，以期为实现具有良好生物活性的葡萄皮渣白藜芦醇的高效提取提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

葡萄皮渣：赤霞珠，烟台某葡萄酒有限公司；

纤维素酶：酶活5万U/g，上海阿拉丁科技有限公司；

白藜芦醇标准品：纯度≥99%，天津尖峰天然产物有限公司；

甲醇、乙醇等：分析纯，国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 主要仪器设备

数控超声水浴锅：CSSX-30型，常州易晨仪器制造有限公司；

电热鼓风干燥箱：101A-2型，上海荣计达仪器科技有限公司；

高效液相色谱仪：Agilent 1200S型，美国安捷伦；

旋转蒸发器：RE-210型，郑州博汇精密科技有限公司；

离心机：KH19A型，浙江恒岳仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 白藜芦醇提取 将葡萄皮渣洗净后置于恒温箱中于45 ℃烘干，粉碎后过40目筛。向粒度小于40目的5 g葡萄皮渣干粉中加入体积分数为60%的乙醇—水溶液100 mL，按照试验设计加入不同质量分数的纤维素酶，调节pH值为5.0后置于数控超声水浴锅中，在设定的温度和功率下采用间歇的方式提取一定时间(每超声2 min，停止2 min，计算超声累计时间)，离心分离(4 000 r/min)、60 ℃蒸发浓缩至无液体，再用5 mL甲醇溶解，过有机滤膜后蒸发浓缩。

为了进行比较分析，分别采用单独酶法(无超声波辅助)和持续超声波法(无纤维素酶)进行提取，其他工艺条件(pH值、时间、温度等)与间歇式超声波辅助酶法的相同。

1.2.2 试验设计 在探索性试验的基础上，以白藜芦醇得率为考察指标，分别以超声波功率、超声累计时间、酶解温度、酶液用量4个因子进行单因素试验，考察其对白藜芦醇得率的影响。

(1) 超声波功率和累计处理时间：在酶解温度为55 ℃，酶液用量为1.4%的条件下，考察超声波功率(200，250，300，350，400 W)和超声累计时间(40，50，60，70，80，90 min)对白藜芦醇得率的影响。

(2) 酶解温度和酶液用量：在超声波功率为300 W，超声累计时间为60 min的条件下，考察酶解温度(40，45，50，55，60，65 ℃)和酶液用量(0.8%，1.0%，1.2%，1.4%，1.6%)对白藜芦醇得率的影响。

(3) 在单因素试验的基础上选取对得率影响较大的因素进行响应面试验。

1.2.3 得率测定与计算 称取干燥至恒重的白藜芦醇标准品20 mg，用甲醇—水溶液(V甲醇∶V水=60∶40)溶解并定容至10 mL，配制成2 mg/mL的标准液，低温保存。用标准液配制成质量浓度分别为2.5，5.0，10，20，30，40，50 μg/mL的白藜芦醇溶液，采用HPLC法测定各标准溶液的吸光度，色谱柱为CNW Athena C18-WP，流动相为乙腈—水(V乙腈∶V水=70∶30)，流量1 mL/min，柱温28 ℃，进样量20.0 μL，检测波长306 nm。通过测定所提取物的吸光度，按式(1)计算白藜芦醇的得率。

(1)

式中：

Y——白藜芦醇的得率，%；

m——标准样品液吸光度值对应的白藜芦醇的质量，μg；

V1——取样体积，mL；

V2——样品液体积，mL；

G——样品称取的质量，g；

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D——样品溶液的稀释倍数。

1.2.4 基本性能表征 使用扫描电镜、傅里叶红外光谱、X-射线衍射分析仪和差示扫描量热分析仪对所提取白藜芦醇的微观形貌、晶相结构、官能团以及热分解性能进行分析。

1.2.5 抗氧化能力检测 白藜芦醇的抗氧化性能通过测定吸光度来进行评价，参照文献[17]中的方法对DPPH·、ABTS·和总抗氧化性能进行测定。参照文献[18]中的方法对白藜芦醇的·OH抗氧化能力进行测定。

2 结果与讨论

2.1 单因素试验

2.1.1 超声波功率与超声累计时间的影响 如图1所示：随着超声累计时间的增加，白藜芦醇得率不断升高，但大部分在累计时间超过60～70 min后增幅减缓，部分甚至出现下降的趋势，其中300，350 W时的得率相对较高，且300 W试样在累计时间为60～70 min时得率达到了最高(0.253%～0.256%)。这可能是因为超声波的空化作用导致葡萄皮渣细胞破碎而使有效成分溶出所致[19]，而较大功率的超声波能够加快这种作用，故在提取初期和大功率超声波的作用下胞内的白藜芦醇溶出较多。同时，超声波的长时间空化作用也易加速活性成分的氧化[15,20]，故超声波功率较大(如400 W)和超声累计时间较长(如90 min)时均易导致得率下降。在试验条件下，当超声波功率为300 W、超声累计时间为60 min时，白藜芦醇的得率较高(0.253%)。因此，后续将以此为基础进行试验分析。

图1 超声波功率和累计处理时间对白藜芦醇得率的影响Figure 1 Effects of ultrasonic power and cumulative treatment time on res yield

使用SPSS软件进行单因素方差分析，结果(表1)表明，超声累计时间和超声波功率对白藜芦醇得率的影响非常显著；R2=0.936，表明反应体系的稳定性好。

表1 超声波功率与超声累计时间对白藜芦醇得率影响的方差分析†Table 1 Variance analysis of effect of ultrasonic power and time on res yield

2.1.2 酶解温度和酶液用量的影响 如图2所示：白藜芦醇得率随着酶液用量的增加而增加。同时，随着酶解温度的升高，得率也逐渐增加，大部分在50～60 ℃附近达到最高，其中酶液用量为1.4%时的得率最高，在55 ℃时达到了0.258%；但当温度继续升高得率反而降低，可能是由高温导致部分纤维素酶失去活性以及在较高温度下白藜芦醇氧化分解所致[21]。因此，合理地控制酶解温度(55 ℃)、超声累计时间(60 min)与酶液用量(1.4%)有利于白藜芦醇的溶出。

图2 酶解温度和酶液用量对白藜芦醇得率的影响Figure 2 Effects of enzymatic hydrolysis temperature and enzyme dosage on res yield

使用SPSS软件进行单因素方差分析，结果(表2)表明，酶解温度和酶液用量对白藜芦醇得率的影响非常显著；R2=0.947，表明反应体系的稳定性好。

表2 酶解温度和酶液用量对白藜芦醇得率影响的方差分析†Table 2 Variance analysis of effect of enzymolysis temperature and enzyme dosage on res yield

2.2 响应面试验

2.2.1 试验设计及结果 由单因素的分析可知，影响得率的因素主要有超声波功率、超声累计时间、酶解温度和酶液用量等。考虑到酶解较为温和而更有利于保持白藜芦醇的生物活性，因此在超声波功率为300 W的条件下，分别选取超声累计时间、酶解温度和酶液用量3个因素，以白藜芦醇得率为响应值，设计三因素三水平的响应面试验，如表3所示。

表3 响应面试验设计中的水平和编码Table 3 Level and code of response surface experiment design

表4 响应面试验结果Table 4 Results of response surface experiment

2.2.2 响应面结果分析 运用Design-Expert 8.0.6软件对数据进行二次多元回归拟合得到多元回归方程：

Y=-0.029A2-0.014B2-0.026C2+0.016AB+0.018AC+0.002 5BC+0.036A+0.018B-0.038C+0.26。

(2)

如表5所示：模型的F值为9.60，P=0.003 5<0.01，非常显著；失拟项P=0.051 1，不显著；复相关系数R2=0.925，接近1，说明该方程拟合度好，模型精度高。试验中的酶解温度、超声累计时间和酶液用量的交互作用对反应体系有显著影响。

表5 模型与方差†Table 5 Model and variance

根据回归方程(2)和表5可知，AB和AC的P值<0.05，即超声累计时间分别与酶解温度和酶液用量具有交互作用，且二次项A2和C2的系数为负值，表明回归方程可求解最大值，即有最高得率。

由图3(a)可知，在合适的酶解温度和超声累计时间下，得率可达到峰值，但随着酶解温度的提高和超声累计时间的延长得率反而降低。这是因为较高的温度和较长的时间会使部分酶液失活，且易导致提取物氧化与分解。由图3(b)可知，在一定的酶解温度条件下，得率随着酶液用量的增加而提高，但达到峰值后降低。这可以解释为：当酶液用量不足时，酶解不彻底；而酶液用量较多时，一方面过剩的酶液不参与反应；另一方面，反应体系中过多的酶液所产生的抑制作用也将影响白藜芦醇的析出[11]。因此，合理地控制酶解温度、超声累计时间与酶液用量有利于反应体系中白藜芦醇的溶出。与图3(a)和图3(b)相比，图3(c)中由酶解温度和酶液用量构成的3D曲面的变化较小，表明其对得率的影响不明显。同时，从表5可知，交互项BC的P>0.05，不显著。由此可见，酶液用量和酶解温度对白藜芦醇得率的影响相对较小。

图3 响应面3D图Figure 3 Response surface 3D diagram

通过对提取工艺进行优化，得到最佳的工艺参数为：超声累计时间43.46 min、酶解温度57.27 ℃、酶液用量1.28%，白藜芦醇的预测得率为0.284%。为了验证该优化工艺的稳定性，在超声波功率为300 W、缓冲液pH值为5.0的条件下，分别选取超声累计时间43 min、酶解温度57 ℃和酶液用量1.3%进行3次验证实验，白藜芦醇平均得率为0.293%，高于表4中的最高得率，与模型预测值接近，说明所建立的回归模型对试验具有较好的指导作用。

2.3 不同提取工艺得率对比分析

基于优化后的工艺条件，按照1.2.1中的提取方法进行试验，对单独酶法(酶液用量1.3%，酶解温度57 ℃、酶解时间86 min)、持续超声波法(功率300 W、超声累计时间86 min，无酶液)及间歇式超声辅助纤维素酶法的提取得率进行比较，结果见表6。由表6可知，单独酶法、持续超声波法所提取白藜芦醇的得率均小于间歇式超声辅助纤维素酶法。这是因为在试验条件下，超声波进行间歇式处理，可以降低因单次长时间处理所引起的温度升高而导致白藜芦醇的氧化；而多次短时间超声波脉冲处理，加上纤维素酶的作用，更容易充分发挥两者各自的优势，形成协同效应。

表6 不同提取方式白藜芦醇的得率Table 6 Resveratrol yield of different extraction methods

2.4 基本性能表征

图4 白藜芦醇粉末的SEM、FTIR、XRD和DSC图Figure 4 SEM image and FTIR, XRD, DSC curves of res

2.5 抗氧化性分析

将试验条件下所得到的白藜芦醇与单独酶法提取和持续超声波法提取的试样对部分自由基清除能力和总抗氧化能力进行对比分析。

2.5.1 对DPPH·的清除能力 如图5所示：3种方法提取的白藜芦醇对DPPH·的清除率均随着质量浓度的增加而逐渐增加，其中采用间歇式超声波辅助酶法提取的白藜芦醇的效果最好，当质量浓度达到4.5 mg/mL时，对DPPH·的清除率达到98.7%，而单独酶法与持续超声波提取的白藜芦醇对DPPH·虽然有一定的清除作用，但相比之下清除率要低很多，两者中最高的也只有78.5%，相差近20%。

图5 不同工艺提取的白藜芦醇对DPPH·的清除效果Figure 5 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on DPPH·

2.5.2 对ABTS·的清除能力 如图6所示：超声波辅助酶法获取的白藜芦醇在质量浓度较低(1.5 mg/mL)时对ABTS·的清除率为94.7%，随着质量浓度的增加清除率减缓。而单独酶法提取的在1.5 mg/mL时的清除率为78.1%，即使在4.5 mg/mL时也只有82.6%；持续超声波法的在1.5 mg/mL时的清除率则更低，仅有58.2%，说明间歇式超声波辅助酶法提取的白藜芦醇具有较好的活性，在低浓度时对ABTS·有较好的清除效果。

图6 不同工艺提取的白藜芦醇对ABTS·的清除效果Figure 6 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on ABTS·

2.5.3 对·OH的清除能力 如图7所示：在试验范围内，对·OH的清除能力随着质量浓度的增加逐渐增强。其中超声波辅助酶法提取的白藜芦醇对·OH的清除率在质量浓度为2.0 mg/mL时达到了73.7%，且在18.0 mg/mL 时高达97.3%，但单独酶法与持续超声波法的分别只有71.3%和51.7%，效果差异较大。

图7 不同工艺提取的白藜芦醇对·OH的清除效果Figure 7 The scavenging effect of resveratrol extracted by different processes on ·OH

2.5.4 总抗氧化能力评价 如图8所示：总体上随着白藜芦醇质量浓度的增加吸光度不断增加，表明总氧化能力逐渐增强。但使用间歇式超声波辅助酶法提取白藜芦醇的吸光度最高，当质量浓度为9.0 mg/mL时达到了2.23，均高于单独酶法与持续超声波法提取的样品。可见采用间歇式超声波辅助酶法提取的白藜芦醇具有较好的生物活性。

图8 不同工艺提取的白藜芦醇的总抗氧化能力Figure 8 Comparison of total antioxidant properties of resveratrol extracted by different processes

上述结果表明，采用间歇式超声波辅助酶法提取的白藜芦醇的抗氧化性能比单独使用一种方法提取的要高。这可以解释为：单独酶法提取时，由于酶解速度较慢，较长的提取时间易导致白藜芦醇的氧化与分解；使用持续超声波提取时，长时间连续超声波处理会使提取液的温度升高，同样易导致提取物氧化；而间歇式超声波处理则可以降低因单次长时间超声所引起的高温氧化。因此，在试验条件下多次短时间超声脉冲处理，加上纤维素酶的作用，更容易充分发挥超声波与纤维素酶各自的优势，形成协同效应。

3 结论

试验表明，酶解温度、酶液用量、超声累计时间和超声波功率等工艺参数对白藜芦醇得率有较大影响。通过响应面试验对提取工艺进行优化后得率有明显提高，达到了0.293%。所提取的白藜芦醇对DPPH·、ABTS·和·OH的清除能力均优于采用单独一种方法提取的试样。当白藜芦醇质量浓度为9.0 mg/mL时其吸光度达到了2.23，显示出优异的抗氧化性能。综上，采用间歇式超声波辅助纤维素酶提取白藜芦醇，可在提高得率的同时改善抗氧化活性，后续将在间歇式超声波辅助双酶法的提取工艺等方面开展深入研究，以获取更高得率与活性。