耐热漆酶ba4基因鉴定与酶学性质分析

2022-09-14王雨辰丁尊丹关菲菲田健刘国安伍宁丰

生物技术通报 2022年8期

王雨辰丁尊丹关菲菲田健刘国安伍宁丰

（1. 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070；2. 中国农业科学院生物技术研究所，北京 100081）

漆酶（laccase，EC1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于多铜氧化酶（MCOs）家族［1］，其活性中心包含4个铜离子：I型铜离子，II型铜离子和一对III型铜离子，可催化多种酚类和非酚类芳香化合物的氧化，同时将氧还原成水［2-4］。漆酶因其优越的底物宽泛性，可氧化降解许多有害物质，使其在对有毒化合物和致癌物生物修复中具有巨大潜力［5-6］。因此，漆酶被广泛用于食品工业、染料脱色、制浆、漂白及造纸废水处理和生物修复等［7-9］，在环境修复和致癌物的降解中起非常重要的作用，然而这些处理过程大多都要在较高的温度下处理，限制了漆酶的活性［10］，这就需要寻找耐受较高温度的漆酶在其过程中得到更好的应用。

苯酚和芳香胺类是构成环境污染的主要物质，漆酶可以氧化降解具有毒性的多种酚类化合物及其衍生物，在生物修复方面具有巨大潜力。先前已有研究表明来源于Trametes versicolor的漆酶能够有效降解真菌毒素［11-12］，而玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）种常见的镰刀菌毒素［13-14］，是谷物中常见的真菌毒素之一，它是通过聚酮化合物途径合成的，在储存谷物粮食期间真菌的大量增长会导致的污染［15］，而且长期接触后对人类和牲畜的健康如生殖和免疫等将产生显著的不利影响，严重的会致畸和致癌。由于ZEN在高温下不易降解，并且利用物理和化学等传统方法降解效果不佳，而且在利用化学试剂降解时会引入不确定因素［16］，所以生物脱毒法具有更好的应用前景。目前，用于准确定量ZEN常规方法包括高效液相色谱（HPLC）［17］、气相色谱-质谱（GC-MS）［18］、高效液相色谱-串联质谱（HPLC-MS/MS）［19］和酶联免疫吸附测定（ELISA）［20］。

此外已有研究发现漆酶对棉酚具有降解效果［21］。每年全球棉籽产量可以提供足够的蛋白质来满足 50亿人每年的膳食需求［22-23］，然而，棉籽植物的色素腺中含有高浓度棉酚，摄入棉酚会使哺乳动物遭受多种持续性伤害［22-24］，因此无法成为安全的植物蛋白，造成很大的资源浪费，而这种细胞毒性源于棉酚分子中的醛基［24-26］。因此，为满足对无醛棉酚棉籽制品和治疗剂的需求，迫切需要一种安全的棉酚解毒手段。

2, 2'-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS），氧化后可产生绿色的ABTS自由基，可用于检测漆酶活性，可作为漆酶氧化底物的介体（在氧存在的情况下介体可作为促氧化剂）［27］。ABTS首先被漆酶氧化成ABTS+，然后氧化成ABTS++。ABTS++是负责底物氧化的形式，因为ABTS++的氧化还原电位为0.855 V，可以氧化许多非酚底物，包括一些真菌毒素［28-29］。

漆酶来源广泛，来源不同的漆酶氨基酸序列具有显著性差异，尽管如此，漆酶的活性中心氨基酸序列具有非常高的保守性。本研究中通过蛋白质数据库保守序列分析比对从蛋白数据库中筛选到可能的漆酶基因，对其进行测定后其发酵液具有漆酶活性，命名为BA4，并在大肠杆菌中异源表达测定了相关酶学性质，并以ABTS为氧化介质研究了漆酶BA4对ZEN和棉酚降解。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 材料大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞购自天根生化科技（北京）有限公司；大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞购自北京全式金生物有限公司；pET30a（+）-ba4重组载体合成于通用生物系统（安徽）有限公司。

1.1.2 试剂蛋白胨、酵母浸取物，Oxford公司；异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、棉酚、ZEN，上海麦克林生化科技有限公司；咪唑（nitilotriacetic acid，NTA）、ABTS，Sigma公司；PEG8000Poly，北京华美智博科技有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯，购自北京化学试剂公司；2×YT培养基：酵母浸取物1%，蛋白胨1.6%，NaCl 0.5%；LB培养基（pH 7.0）：酵母浸取物0.5%，蛋白胨1%，NaCl 1%

1.1.3 仪器摇床，太仓市科技器材厂，型号HZ-9211K；水浴锅，北京长风仪器仪表公司，型号DK-8D；蛋白电泳系统北京六一仪器厂，型号DYY-2C；超声破碎仪，宁波新芝科技有限公司，型号JY29-ⅡN；微孔板酶标仪，美国molecular devices公司；恒温培养箱，天津市泰斯特仪器有限公司，型号DH3600；分光光度计日本日立公司，型号Hitachi-3310；高效液相色谱仪器，日本岛津公司；Eclipse Plus C18，4.6 mm×50 mm，5 μm，安捷伦科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 漆酶BA4基因筛选及基因合成基于前期实验室从土壤宏基因组筛选出的高比活漆酶13B22［30］，通过UniParc蛋白数据库，对其漆酶基因保守序列分析，筛选与漆酶13B22氨基酸相似性>40%的漆酶基因，通过最适反应温度回归预测模型（PMT）筛选出比漆酶13B22更耐热的漆酶基因（http://www.elabcaas.cn/pird/preoptem.html），命名为ba4。筛选到BA4漆酶基因，通过密码子优化后进行全序列合成，并构建在pET30a（+）载体上（限制性内切酶为BamH I和Hind III）在大肠杆菌中异源表达。

1.2.2 大肠杆菌漆酶基因大肠杆菌中的诱导表达将含有重组载体pET30a（+）-ba4的BL21（DE3）表达菌株划线于含有50 μg/mL的卡那霉素的LB固体平板，37℃平恒温培养过夜；挑取单克隆接种致5 mL含有50 μg/mL的卡那霉素的2×YT液体培养基，37℃、200 r/min培养8-12 h；以1%的接菌量转接至1 L含有50 μg/mL的卡那霉素的2×YT培养基中，30℃、120 r/min振荡培养至OD600为0.6-0.8，分别加入终浓度为0.2 mmol IPTG和0.25 mmol/L CuCl2，25℃、120 r/min诱导培养4 h后静置诱导培养20 h后，收集菌体，加入100 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液重悬菌体，并于低温条件下超声破碎，8 000×g、4℃条件下离心30 min后取上清备用。

1.2.3 漆酶蛋白纯化与浓缩层析柱中加入过滤垫片，在两层过滤垫片中加入4 mL Ni-NTA Agarose柱材，直至柱材沉淀，压实后排出气泡。在4℃下30%乙醇中保存备用；层析柱中30%乙醇流尽加入5个柱体积的超纯水，流尽后加入3-5 mL 0.1 mol/L硫酸镍；添加30 mL NTA-0平衡层析柱，将层析柱和收集管置于冰上，并将粗酶液加入层析柱中，收集层析柱流穿粗酶液重新加入层析柱中，重新收集穿透液；分别用20 mL NTA-0、NTA-20和NTA-40洗脱结合能力较弱的杂蛋白；最终用15 mL NTA-200洗脱并收集目的蛋白洗脱液；向层析柱中分别加入10个柱体积0.5 mol/L NaOH，5个柱体积1.5 mol/L NaCl和10个柱体积超纯水清洗层析柱，最后将层析柱保存于30%乙醇中。将NTA-200洗脱目的蛋白放入透析袋中置于5 L含有20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）的缓冲液于4℃透析过夜；将透析过夜蛋白用PEG8000在4℃条件下浓缩，用2 mL 20 mmol/L Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液将浓缩蛋白收集至离心管中。SDS-PAGE检测蛋白纯化效果，并用BCA法测定蛋白浓度。

1.2.4 漆酶BA4酶学性质测定漆酶BA4酶活测定方法，取750 μL A液［0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸（pH 6.0）］和200 μL B液（5 mmol/L ABTS）于酶活管中，37℃预热2 min后加入50 μL纯化漆酶蛋白（浓度）反应3 min后（1 mL酶活体系），立即置于冰水混合物中终止反应，使用酶标仪在ε420nm条件下读数。漆酶一个酶活力单位（U）定义为最适条件下，每分钟催化1 μmol底物氧化所需要的酶量，漆酶酶活测定体系如表1所示。

表1 漆酶酶活测定体系Table 1 Determination system for laccase enzyme activity

漆酶酶活力计算公式为：A=（106×ε-1）×（V总×V酶-1）×（∆OD×∆t-1）

其中A为酶的稀释液的酶活，单位为U/L；ε为吸光系数，即ε420nm=36 000 L/（mol·cm）；V总为漆酶酶活测定反应总体积，单位为L；V酶为漆酶酶活测定反应添加的酶液体积，单位为L；∆t为反应时间，单位为min；∆OD为反应前后吸光值的差值。

漆酶BA4漆酶最适温度和最适pH测定：将纯化后的漆酶BA4蛋白定量后，稀释0.25 mg/mL，在0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸（pH 6.0）缓冲液下，分别在35、40、45、50、55、60、65和70℃下测最适温度。在确定最适温度的条件下测定最适pH，在pH 3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0和7.5的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸的缓冲溶液测定。酶活测定方法按照漆酶酶活测定方法测定，计算时以最适温度的酶活为100%，以计算各温度的相对酶活力。

漆酶BA4动力学参数测定：配置不同浓度ABTS（mmol/L），浓度分别为150、300、450、900、1 350、1 800、2 250、2 700、3 150、3 600、4 050、4 500和4 950 μmol/L，在最适温度50℃和最适pH 5.5条件下测定，测酶活体系为1 mL，测定结果要相应的去除对应底物浓度的吸光值，测定动力学参数的方法按照漆酶酶活测定方法。采用GraphPad Prism 9.0软件拟合非线性曲线，通过曲线计算出动力学参数Km、kcat和kcat/Km。

1.2.5 漆酶BA4对ZEN和棉酚的降解棉酚标准曲线绘制：称取2 mg棉酚标准品溶于1 mL二甲基亚砜（DMSO）中，配置成2 mg/mL 母液，依次加入不同量棉酚标准品稀释于终浓度为50 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸（pH 6.0）和1 mmol/L ABTS溶液中，如表2所示。棉酚标准品浓度在0.05-0.2 mg/mL之间，如图1所示。通过HPLC法测定棉酚，HPLC条件参照国标法（GB 5009.148-2014）［31］，使用Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）反相色谱柱，含有甲醇和磷酸溶液（85/15，V/V）作为流动相，流速为1 mL/min，上样量20 μL，通过UV检测器在235 nm监测代谢物的洗脱。柱温为40℃。

表2 标定棉酚所用浓度Table 2 Concentrations of gossypol in marking the standard curve

图1 棉酚标准曲线Fig. 1 Gossypol standard curve

漆酶BA4降解棉酚：在400 μL催化反应体系中含有终浓度1 mg/mL棉酚、1 mmol/L促氧化剂ABTS、50 mmol/L Na2HPO4-柠檬酸（pH 5.5）缓冲溶液、0.25 mg/mL纯化后的蛋白稀释液，分别在40和50℃条件下反应1 h。反应结束后用三倍体积的甲醇终止反应。

棉酚相对降解率：棉酚相对降解率（%）=（漆酶未处理前棉酚峰面积-漆酶处理后棉酚峰面积）×100% /漆酶未处理前棉酚峰面积

ZEN标准曲线绘制：称取2.5 mg ZEN标准品溶于1 mL二甲基亚砜中（DMSO），配置成2.5 mg/ mL的母液，依次加入不同量ZEN标准品稀释于终浓度为50 mmol/L的Na2HPO4-柠檬酸（pH 5.5）和1 mmol/L ABTS溶液中，如表3所示。ZEN标准品浓度在0.05-0.2 mg/mL，峰面积与ZEN浓度成线性关系，如图2所示。通过HPLC法测定ZEN浓度，使用Eclipse Plus C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）的反相色谱柱，流动相为含有0.06% TFA的水相和含有0.05% TFA的乙腈有机相，流速为1 mL/min，上样量20 μL，通过UV检测器在316 nm监测代谢物的洗脱。柱温为35℃。洗脱程序为：水相，100%，4 min；有机相，0-100%，25 min；流动相B，100%，6 min。

表3 标定玉米赤霉烯酮所用浓度Table 3 Concentrations of ZEN in marking the standard curve

图2 玉米赤霉烯酮标准曲线Fig. 2 ZEN standard curve

漆酶BA4降解ZEN：将纯化后的蛋白稀释到终浓度为0.25 mg/mL，加入终浓度为1 mmol/L的ABTS作为促氧化剂，在50 mmol/L的Na2HPO4-柠檬酸（pH 5.5）缓冲溶液中进行。0.1 mg / mL ZEN的条件下对400 μL反应体系进行催化反应，反应结束后用3倍体积的甲醇终止反应，降解时间为2 h，降解温度分别为40℃和50℃。

ZEN相对降解率计算：ZEN相对降解率（%）=（漆酶未处理前ZEN峰面积-漆酶处理后ZEN峰面积）×100%/漆酶未处理前ZEN峰面积

2 结果

2.1 漆酶基因ba4的克隆

通过PMT模型预测出BA4漆酶的最适温度为46.17℃，高于漆酶13B22预测的最适温度（32.5℃）。漆酶ba4基因全长1 860 bp，编码620个氨基酸。通过BLASTX分析，与来源于Rhodothermus marinusAA3-38基因组的铜抗性系统多铜氧化酶（WP_161541154.1）的氨基酸序列100%相同，属于Copper_res_A超家族。通过Copper_res_A 的保守域比对，使用 NCBI 数据库工具 CDART（保守域架构在线检索工具）进行分析，确定出104条氨基酸序列，与来源于Klebsiella michiganensis的铜抗性系统多铜氧化酶（STW26195.1）相似性最高，为58.75%，其次与来源于Henriciella algicola的铜抗性系统多铜氧化酶（WP_119452233.1）相似性为54.3%，证明漆酶ba4基因是Copper_res_A超家族新的漆酶基因。对ba4基因全序列优化合成后构建在pET30a（+）质粒上，转入大肠杆菌BL21（DE3）中，鉴定获得阳性菌株。

2.2 漆酶基因ba4在大肠杆菌中的表达与纯化

将含有质粒pET30a（+）-ba4的E.coliBL21（DE3）的工程菌诱导培养后，分别对上清，沉淀和纯化后的蛋白进行SDS-PAGE 电泳检测。结果表明漆酶BA4蛋白主要以不溶性蛋白形式存在于沉淀中，少量可溶性蛋白在破碎上清中，经镍柱纯化可溶性蛋白BA4，可获得分子量为70 kD的相对单一目的蛋白条带，与预期大小一致，如图3所示。

图3 漆酶BA4微好氧发酵20 h检测Fig. 3 Expression of BA4 after micro aerobic fermentation for 20 h

2.3 漆酶酶学性质分析

2.3.1 最适温度对纯化获得的漆酶BA4进行酶学性质测定，结果表明在温度45-65℃之间均可测得较高的酶活，其中在50℃时酶活最高（图4-A）；在最适温度50℃下测定在不同pH值条件下的酶活，结果表明pH在5.0-6.5之间时相对酶活在70%以上，其中在pH 5.5时达到最高酶活。在50℃下pH 5.5时测定漆酶BA4酶比活为190.9 U/mg（图4-B），相较于前期实验室测得的漆酶13B22最适温度提高了10℃，酶比活提高了3倍左右。

图4 温度和pH对漆酶BA4的影响Fig. 4 Effects of temperarure and pH on BA4

2.3.2 酶动力学参数在最适温度50℃和最适pH 5.5条件下，以不同浓度梯度ABTS为底物（150-4 950 μmol/L），测得的酶活力通过用GraphPad Prism 9.0软件拟合非线性曲线，如图5所示。通过曲线计算出Km为（2 144.5±358.5）μmol/L，kcat为（44.06±3.14）min-1，最大反应速率为623.2 μmol/（min·g），kcat/Km为（0.020 9±0.002）L/（μmol·min）。

图5 漆酶 BA4 的米氏方程曲线Fig. 5 Michaelis-menten equation curve of laccase BA4

2.4 漆酶BA4对ZEN和棉酚的降解作用

从色谱图可以看出经漆酶BA4在40℃和50℃分别处理的ZEN底物峰（27.68 min）和棉酚底物峰（12.59 min）均比未用漆酶处理（CK）的峰面积显著降低，说明漆酶对ZEN和棉酚都有一定降解作用（图6-A和C）。计算底物峰面积变化的结果表明，漆酶BA4在40℃下对浓度为0.1 mg/mL（是我国规定小麦中ZEN的检测含量的200倍）ZEN的降解率达到了93%，该浓度在50℃的降解率达到了97%左右（图6-B），表明漆酶BA4在50℃下对ZEN降解效果相对较好，并且几乎将0.1 mg/mL ZEN在2 h内全部降解。通过计算棉酚在1 h相对降解面积，浓度为1 mg/mL的棉酚在40℃和50℃的降解率均为30%左右（300 μg/mL）（图6-D）。在温度上漆酶BA4在最适温度下（50℃）对ZEN的降解率更高，而漆酶BA4在40℃和50℃下对棉酚降解率并没有显著差异。

图6 漆酶BA4对ZEN和棉酚的降解作用Fig. 6 Degradation of ZEN and gossypol by laccase BA4

3 讨论

随着多年研究发现，漆酶来源广泛，已经获得大量漆酶基因，但由于自身性质限制，还未获得能够满足工业应用及环境需求的漆酶蛋白，因此对于漆酶的开发改造的研究仍至关重要。本文研究的漆酶在NCBI数据库比对后发现其与来源于Rhodothermus marinusAA3-38基因组上的氨基酸序列（WP_161541154.1）高度同源，所以此漆酶BA4可能来源于海洋红嗜热盐菌（R. marinus）。漆酶BA4在大肠杆菌表达系统中可溶性表达量较低，主要以不可溶性包涵体的形式存在，我们也尝试过在毕赤酵母表达系统中对其进行表达，然而其在酵母表达系统中的外泌表达量较低，酶活性较低，今后我们可以通过分子改良策略对ba4基因进行改造，添加融合标签，优化表达条件等提高其可溶性表达量。

棉酚大量存在于棉葵科植物中，尤其是在棉籽中，在食品和饲料应用方面一直存在问题。由于漆酶降解棉酚机理方面的相关文献报道较少，目前仅Wang等［21］研究证明了来源于Trametes versicolor的漆酶可以催化棉酚醛和羟基的分子内环化为邻半醌自由基，并产生释放的·OH自由基，还进一步发现，醛基的氧化显著降低了生殖毒性和肝毒性。而棉酚属于多酚羟基双萘醛类化合物，因此可以将棉酚视作萘一类衍生物，而微生物对萘的脱毒机理研究报道较多［32-34］，微生物以萘作为碳源起到脱毒作用，棉酚与萘的结构相似，可能在脱毒脱毒机理方面具有一定相似性，可以通过萘脱毒机理，进一步研究棉酚降解机理。漆酶BA4对棉酚的降解是否将其氧化为具有解毒作用的环化棉酚尚未研究，其是否具有新的降解途径需进一步研究发现。

先前研究表明不同的介体对底物的促氧化效率不同［35］，所以在后续研究中要对ZEN与棉酚调整介体以提高底物降解率。来源于Pleurotus pulmonarius漆酶Lac2通过ABTS、2, 2', 6, 6'-四甲基-1-哌啶氧基（TEMPO）、乙酰丁香酮（acetosyringone，AS）和丁香醛（syringaldehyde，SA）作为ZEN和黄曲霉素不同的降解介体，比较降解率，并解释了ABTS的氧化还原电位（0.472 V）低于漆酶（0.5-0.8 V）［28］，因此很容易被漆酶氧化。对丁香酸甲酯，芥子酸（sinapic acid）和阿魏酸（ferulic acid）等［36］不同介体可以促进漆酶对真菌毒素的降解，可以进一步探索能够提高漆酶BA4对ZEN和棉酚降解的介体。