鸡肉中亚胺硫磷等26种农药残留的液相色谱串联质谱法不确定度的评定
2022-09-14丁葵英许文娟吕佳宁郭礼强田国宁
丁葵英 许文娟 吕佳宁 郭礼强 田国宁
1.潍坊海关 山东潍坊 261041 2.潍坊医学院公共卫生与管理学院 山东潍坊 261043
为保证农产品质量和产量，农药被广泛应用于农业生产中，但过量农药残留，会给生物环境和人体健康带来危害[1,2]，因此国内外标准都对食品中农药残留量有严格的要求[3,4]。食品中多农药残留同时检测技术文献已有许多报道[5～7]，但对检测结果不确定度的分析评定影响报道较少。检测结果处于最大残留限量临界点附近时，判定较为困难，易引起争议，因此需要对测定过程中的不确定度进行分析和评定[8～10]；不确定度是与测量结果相关的表征被测量值的分散性参数[11]，对测量结果的可疑程度和非负参数的分散性提供重要保障[12,13]。鸡肉基质较复杂，对于测定其中的农药残留含量干扰严重，测定过程中的环境、仪器和操作步骤等都可能对测定结果造成误差[14,15]，所以评定其农药残留测定过程中的不确定度是非常有必要。
本文对液相色谱-质谱法，测定鸡肉中亚胺硫磷等26种农药残留量检测过程中不确定度的来源和影响，根据CNAS-CL01-G003：2021《测量不确定度的要求》等[16]相关指导性文件要求进行分析和评定。
1 实验部分
1.1 仪器与设备
液相色谱-串联质谱仪安捷伦647，配有电喷雾离子源(ESI)，美国Agilent公司；
碾磨仪GM 200，德国RETSCH公司；
高速分散均质器IKA-T25，德国IKA公司；
电子天平XS303S，瑞士Mettler公司；
移液枪，100μL、1 000μL和10mL，皆为德国eppdf公司；
10mL棕色容量瓶。
本文用到的器具按照《常用玻璃量器检定规程》(JJG 196-2006)[17]、《移液器检定规程》(JJG 646-2006)[18]将各器具引入的相对不确定度列表1。
表1 各器具最大允差和相对标准不确定度Table 1 the maximum allowance and relative standard ofthe instruments
1.2 药品与试剂
甲醇、乙腈(色谱纯)，美国Fisher公司；
正己烷(色谱纯)，德国Merk；
无水硫酸镁(分析纯)，天津市光复精细化工研究所，使用前在500℃马弗炉内烘5h，20℃时取出冷却备用；
C18粉、PSA粉，Agela technologies inc公司；
灭蝇胺、乙酰甲胺磷、涕灭威亚砜、涕灭威砜、久效磷、内吸磷-S-砜、涕灭威、乙拌磷亚砜、乙拌磷砜、氯吡脲、氯虫苯甲酰胺、亚胺硫磷、嘧菌酯、乙拌磷、氟甲腈、除虫脲、氟虫腈、氟虫腈硫醚、吡唑醚菌酯、苯醚甲环唑、丙溴磷、氟啶脲、溴氰菊酯标准品，(乙腈中1 000μg/mL)，北京坛默有限公司；
内吸磷-S-亚砜、氟虫腈砜和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐(乙腈中1 000μg/mL)，阿尔塔科技有限公司；
鸡肉样品来自于报检公司的出口样品。
1.3 实验方法
1.3.1 标准溶液配制
1.3.1.1 混合标准储备液配制
用100μL移液枪分别准确移取100μL的1 000μg/mL的灭蝇胺、亚胺硫磷等26种农药液体标准溶液于10mL的容量瓶中，用乙腈稀释定容，配制成10μg/mL的混合标准储备液，于-18℃下存放。
1.3.1.2 基质匹配混合标准液的配制
用100μL移液枪移取10μg/mL混合标准溶液50μL于10mL的棕色容量瓶中，用空白鸡肉基质提取溶液定容，得0.5μg/mL标准中间液。精密移取标准中间溶液，用空白样品基质溶液配制成系列混合标准工作溶液，现用现配。
1.3.2 样品提取和测定
称取10g试样(精确至0.01g)于50mL离心管中，加入10mL乙腈，用高速组织捣碎机在15 000r/min，匀浆提取1min，加入4g无水硫酸镁、1g氯化钠，再匀浆提取1min，在5 000r/min离心5min，定量吸取上清液2mL至内含无水硫酸镁300mg，50mgPSA、5mg C18组合粉末的塑料离心管中，涡旋混匀1min，5 000r/min离心5min，吸取上清液过0.22μm微孔滤膜后进行液相色谱-串联质谱法测定，外标法定量。
1.4 LC-MS/MS条件
LC条件：色谱柱SB-C18(3.0×100mm，2.7μm)，柱温40℃，进样量1μL，流动相A为0.1%甲酸水，流动相B为甲醇。
MS条件：离子源ESI，扫描方式为正负离子同时扫描，检测方式为动态多反应检测(dMRM)。
1.5 不确定来源分析
1.5.1 数学模型
根据测定方法，鸡肉中各农药含量按公式(1)计算。
(1)
式中：
x—样品中待测组分残留量，单位为(μg/kg)；
c—从基质匹配标准工作曲线得到的试样溶液中被测物的质量浓度的数值，单位为(μg/mL)；
A—样品中待测组分的峰面积；
V—样品提取液的体积，单位为(mL)；
As—标准工作溶液中待测组分的峰面积；
m—样品称样量，单位为(g)。
1.5.2 不确定度来源
按规范方法抽样和制备样品均匀性引入的不确定度忽略不计[19]。从测量过程和数学模型分析，本方法测定鸡肉中26种农药的不确定度来源见表2。
表2 测定鸡肉中各目标化合物含量的相对不确定度一览表Table 2 Relative uncertainty of determination of target compounds in Ginger
2 测量不确定度评定
2.1 重复性不确定度urel(rep)
制备鸡肉空白样品，添加一定体积的10μg/mL标准储备液，使各化合物的添加浓度为20.0μg/kg，按照1.3的方法进行前处理和1.4的上机方法测定，重复测量8次，外标法定量。标准曲线配制采用0.5μg/mL的标准中间液，吸取不同体积上述标准中间液后，用空白鸡肉基质提取液定溶，配制成浓度为0.005、0.007、0.010、0.020、0.030、0.040μg/mL的标准工作液，测得的峰面积与标准溶液的浓度拟合，得到标准工作曲线的线性回归方程y=ax+b(a为截距，b为斜率)和方程的线性相关系数R2，然后采用外标法定量测定，各化合物的回收浓度值如表3所示。
表3 重复测定8次的数据及线性相关参数Table 3 Data and linear correlation parameters of 8 repeated measurements
通过标准偏差计算测量重复性引入的不确定度分量。通过公式(2)计算8次测量结果的各化合物的平均值。
(2)
采用贝塞尔公式(3)计算测量值的相对标准偏差sc。
(3)
按照相对不确定度公式(4)计算各化合物的不确定度。
(4)
2.2 前处理过程引入的不确定度urel(q)
26种化合物是同时加入空白样品，前处理过程是同时进行，所以各化合的前处理过程的相对标准不确定度是相同的，其评定过程如下。
2.2.1 称样引入的相对标准不确定度urel(m)
由电子天平(XS303S)的校准证书得到，0～50g称量范围内，本实验所用天平的最大误差为±0.01g，服从矩形分布，标准不确定度公式(5)为：
(5)
待测样品平行称样量为8次，其称样量为10.01、10.02、10.05、9.99、9.98、10.02、10.03、10.00g：
计算相对不确定度公式(6)为：
(6)
称量所带入的相对不确定度为：1.64×10-3。
2.2.2 加入提取体积引入的不确定度urel(V)
量取体积的不确定度有量取容器决定的，用10mL的移液枪加入提取试剂乙腈移取，10mL的移液枪最大允差为±60μL见表1，按照矩形分布，其相对不确定度公式(7)为：
(7)
2.2.3 前处理过程温度引入的不确定度urel(temp1)
前处理过程操作均是一般在(20±5)℃下进行的，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3℃，按照矩形分布，其相对不确定度公式(8)为：
(8)
前处理过程引入的相对不确定度urel(q)公式(9)为：
urel(q)=
3.91×10-3
(9)
2.3 目标化合物的质量浓度c引入的相对标准不确定度urel(c)
标准溶液中农药的浓度c的标准不确定度urel(c)公式(10)，主要来源于标准物质纯度、标准工作曲线拟合、标准物质配制过程。
(10)
2.3.1 标准物质纯度的相对标准不确定度urel(c1)
通过查阅26种化合物的标准物质证书知，其标准浓度为值1 000μg/mL，内吸磷-S-亚砜、氟虫腈砜和甲氨基阿维菌素苯甲酸盐扩展不确定度为5%(k=2)，其他物质扩展不确定度为：2%(k=2)，各物质的相对标准不确定度公式(11)与公式(12)为：
(11)
(12)
2.3.2 校准曲线引入相对不确定度urel(c2)
测试过程中各化合物的标准工作曲线的线性回归方程y=ax+b(a为截距，b为斜率)和方程的线性相关系数R2，见表2。对试样进行8次平行测定，由试样峰面积在标准工作曲线的线性回归方程求得的平均浓度为如表2所示，则由最小二乘法拟合标准工作曲线所引入的标准不确定度公式(13)为：
(13)
式中，SR-标准溶液峰面积残差的标准差公式(14):
(14)
c0—大姜样品中各化合物浓度的平均值;
ci—绘制曲线标准溶液的各浓度点;
Ii—各标准溶液浓度点的峰面积;
n—标准溶液的测定次数为6；
p—试样的测定次数为8。
最小二乘法拟合标准工作曲线引入的相对标准不确定度公式(15)为：
(15)
2.3.3 标准物质配制过程的相对标准不确定度urel(c3)
购入的乙拌磷标准物质为1 000μg/mL液体标准溶液，配制过程无需称量，仅使用移液枪和容量瓶，具体见配制过程。
(1)用100μL移液枪吸取1 000μg/mL的26种化合物标准品100μL于10mL的容量瓶中，乙腈定容，配制成10μg/mL混合标准中间液，按照矩形分布此过程的相对标准不确定度公式(16)为：
1.16×10-2
(16)
(2)用1 000μL移液枪吸取10μg/mL标准溶液500μL于10mL的容量瓶中采用空白鸡肉基质提取液定容至刻度，配制成0.5μg/mL的26种混合标准中间液，此过程的相对标准不确定度公式(17)为：
1.16×10-2
(17)
(3)温度效应。混合标准中间液操作均一般是在(20±5)℃下进行的，乙腈的体积膨胀系数为1.37×10-3℃；乙拌磷标准使用液在(20±5)℃条件下进行配制，定容基质溶液按一级水的体积膨胀系数为2.1×10-4℃，按照矩形分布相对标准不确定度公式(18)为：
urel(Vtemp2)=
2.00×10-3
(18)
综上，标准溶液配制过程的相对不确定度公式(19)为：
urel(c3)=
1.65×10-2
(19)
urel(c)—标准溶液中农药的质量浓度c的相对标准不确定度公式(20)为：
(20)
2.4 合成标准不确定度
因为测量的重复性、前处理过程、标准物质的浓度各输入量均为乘积关系且之间不相关，根据JJF1059.1-2012[20]，实验实际测得鸡肉样品中的8次重复测定其含量浓度的平均值，计算合成标准不确定度公式(21)为：
(21)
2.5 扩展不确定度UP
取置信水平P=95%，包含因子k=2，则扩展不确定度公式(22)为：
Up=k×u(x)
(22)
2.6 结果报告
26种化合物的测试结果报告公式(23)为：
(23)
各化合物的结果报告如表4所示。
表4 各不确定度分量和结果报告
3 结论
本研究对鸡肉中26种农药残留检测的液相色谱-串联质谱法的测定过程中，各步骤带来的不确定度进行评定，为动物源性中农药残留测定不确定度评定提供依据。结果表明，对最终测量不确定度贡献最大的是标准物质配制过程和标准物质的纯度，其次为校准曲线拟合、测量重复性、前处理过程的称样和提取试剂加入容器，但前处理过程和标准物质配制过程中温度带入的不确定度可以忽略。因此，实际检测中，为提高检测结果的准确性，要采用经过检定的容器和购买有证标准物质，配制6个点以上的校准曲线；可通过提高仪器和环境稳定性、提高实验人员操作技能，减少系统误差，以降低测定过程重复性引入的不确定度。总之，通过全面评定测量不确定度，可使检测数据更加科学、合理，使报告结果更加可信。
