霍山石斛抗急性炎症有效部位筛选研究

谷仿丽，黄仁术，何晓梅，陈乃东，韩邦兴，陈乃富

(1.皖西学院 生物与制药工程学院；2.安徽省中药资源保护与持续利用工程实验室，安徽 六安 237012)

炎症是机体免疫系统对感染、伤害或刺激作出的自我防御过程，[1]不同病因可损伤机体不同部位，引起诸如过敏性疾病、胃炎、关节炎、动脉粥样硬化、癌症等疾病。[2]抗炎药物可有效缓解炎症症状，主要包括非甾体抗炎药、糖皮质激素、肿瘤坏死因子抑制剂及中草药提取物等，[3]非甾体抗炎药可损害胃粘膜、睾丸粘膜、升高血压，引发溃疡、中风和心力衰竭等疾病；[4-7]糖皮质激素由于产生如骨质疏松症、高血糖、胰岛素抵抗、高血压等副作用，使用受到了限制；[8]中药有效成分如多糖、生物碱、黄酮等已被证明具有较好的抗炎作用，且毒副作用小，[9-10]具有较好的应用前景。

霍山石斛(DendrobiumhuoshanenseC.Z.Tang et S.J.Cheng)属于传统名贵中药材，主产于安徽省霍山县及周边地区，生长条件极为苛刻，含有多糖、石斛碱、多酚及多种微量元素等，[11]研究表明霍山石斛具有抗肿瘤、抗氧化、保肝、调节免疫等作用。[12-13]戴玮等研究发现霍山石斛多糖具有体外抗炎作用，[14-15]但其体内抗炎作用未见报道。本课题组前期将新鲜霍山石斛粉碎成汁、离心取上清液灌胃小鼠，发现可以降低小鼠足肿胀度，表明霍山石斛具有抗炎作用，但哪种成分起到抗炎作用？为此，本课题拟用小鼠足肿胀模型，筛选霍山石斛抗炎的有效部位，为霍山石斛的进一步开发应用打下基础。

1 实验材料

1.1 实验动物

昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，体重20±2g，购自南京医科大学动物实验中心，许可证号：SCXK(苏)2002—0031。整个实验过程小鼠均正常饮食饮水。经院实验动物伦理委员会审批，每批小鼠实验结束后施行安乐死。

1.2 药物和试剂

霍山石斛采自皖西学院霍山石斛种植基地(经皖西学院陈乃富教授鉴定为正品)，清洗，杀青，103℃烘干，粉碎过40目筛，继续烘干至恒重，得干霍山石斛粉末，备用。COX-2、PGE2、IL--1β、TNF-α试剂盒由南京建成生物工程研究所生产；角叉菜胶由美国Sigma公司生产，生产批号：59C-2281；阿司匹林肠溶片由拜耳医药保健有限公司生产，批准文号：国药准字J20130078。阿司匹林片研成粉末，临用前用0.5%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)配制成一定浓度溶液备用。

1.3 实验仪器

UV1902光束紫外可见分光光度计(上海奥析科学仪器有限公司)，Synergy H1多功能酶标仪(美国佰腾仪器有限公司)，MY-20手持式电动组织研磨器粉碎器(上海净信实业发展有限公司)，等。

2 方法

2.1 霍山石斛抗炎有效成分筛选

2.1.1 霍山石斛水提物与乙醇提取物抗炎作用比较

取霍山石斛干粉100 g，平均分为2份，以1∶8料液比分别加入蒸馏水、75%乙醇800 mL，分别于65 ℃水浴中提取3 h，提取2次，合并滤液，减压浓缩至相对密度1.15，冷冻干燥，粉碎干燥物，过100 目筛，得霍山石斛水提物11.234 g、醇提物8.267 g干粉。

取48只小鼠，随机分为4 组，分别为空白对照组、阿司匹林阳性对照组、霍山石斛水提物及乙醇提取物组，小鼠按20 mL/kg等容量灌胃，分别给予0.5%羧甲基纤维素钠溶液灌胃、阿司匹林300 mg/kg、霍山石斛组水提物100 mg/kg、霍山石斛醇提物100 mg/kg，1次/d，连续3d，于第4 d给药30 min后每只小鼠右后足足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1mL。用千分尺分别于造模前、后1、2、4、8 h分别测定右后足跖厚度(单位：mm)，以足肿胀度判断药物抗炎作用强弱。[16]足肿胀度=造模后足跖厚度—造模前足跖厚度。

2.1.2 霍山石斛水提物醇沉及醇溶部位抗炎作用比较

取霍山石斛干粉100 g，平均分为2份，以1∶8料液比分别加入蒸馏水800 mL，于65 ℃水浴中提取3 h，提取2次，合并滤液，减压浓缩至提取物相对密度1.13，取出提取物，缓慢加入95%乙醇达溶液量的85%，边加边搅拌至均匀，保鲜膜封口，4 ℃冰箱保存24 h，4000转离心10min，取沉淀物冷冻干燥；醇溶部位减压浓缩至相对密度1.09，冷冻干燥；将干燥物粉碎，过100目筛，得霍山石斛水提物醇沉部位10.112 g、醇溶部位7.357 g干粉。

取48只小鼠，随机分为4组，分别为空白对照组、阿司匹林阳性对照组、霍山石斛醇沉及醇溶物组，空白组及阿司匹林组给药同2.1.1，霍山石斛组分别给予霍山石斛醇沉物100 mg/kg、醇溶物100 mg/kg灌胃，按2.1.1方法给药、造模，计算足肿胀度。

2.1.3 霍山石斛水提物醇沉物及多糖抗炎作用比较

取霍山石斛干粉300 g，按2.1.2方法提取水提醇沉物61.332 g，取50 g醇沉物，以Sevag法去蛋白，纤维柱法分离、得精制多糖25.912 g，用蒽酮-硫酸法[17]测多糖含量，霍山石斛多糖(Dendrobiumhuoshanensepolysaccharide，DHP)类物质为精制多糖提取物的67.33%。

取48 只小鼠，随机分为4 组，分别为空白组、阿司匹林阳性对照组、霍山石斛醇沉组及多糖组，空白组及阳性药物组同2.1.1，霍山石斛组分别给予霍山石斛醇沉物100 mg/kg、多糖100 mg/kg灌胃，按2.1.1方法给药、造模，计算足肿胀度。

2.2 霍山石斛多糖抗急性炎症作用研究

取小鼠60 只，随机分为5 组，分别为空白对照组、阿司匹林阳性对照组，霍山石斛多糖(高、中、低)剂量组，空白组及阳性药物组同2.1.1，霍山石斛多糖组分别给予霍山石斛多糖(200、100、 50mg/kg)灌胃，给药时间及造模方法同2.1.1。于末次给药后1 h 测量足肿胀值后摘眼球取血，ELISA法检测环氧合酶-2(Cyclooxygenase，COX-2)；自足踝上0.5 cm处剪下肿胀足跖，加入9 倍生理盐水，用组织粉碎机粉碎为组织匀浆液，4000 转离心10 min，取上清液，ELISA法检测前列腺素E2(Prostaglandin E2，PGE2)、白介素-1β(Interleukin-1beta，IL-1β)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alph，TNF-α)水平。

2.3 数据处理

3 结果与分析

3.1 霍山石斛水提物与乙醇提取物抗炎作用比较

结果如图1。造模后，空白对照组小鼠足肿胀值在4 h达峰值，随后缓慢降低。与空白对照组比较，霍山石斛水提物组、阿司匹林组在造模后1、2、4、8 h足肿胀度均显著降低(P<0.05)，二者之间无显著差异，霍山石斛醇提物组小鼠足肿胀度在各个时间点均低于空白组，但无显著性差异(P>0.05)；霍山石斛水提物组足肿胀度显著低于醇提物组(P<0.05)，表明霍山石斛水提物具有抗炎作用，醇提物无显著抗炎作用。因此，课题组分离了霍山石斛水提物，寻找其抗炎有效部位。

图1 霍山石斛水提物与醇提物抗炎作用

3.2 霍山石斛水提物醇沉及醇溶部位抗炎作用比较

水提物中的成分如色素、多糖、蛋白、淀粉等成分不溶于乙醇，因此，霍山石斛水提物溶液中加入乙醇，可将其分离为醇沉物和醇溶物。

结果如图2。造模后空白组小鼠足肿胀表现出与3.1相同的规律性，表明角叉菜胶诱导的足肿胀模型比较稳定。与空白组比较，霍山石斛水提醇沉物组、阿司匹林组在造模后的1、2、4、8 h足肿胀值均显著降低(P<0.01或P<0.05)，二者之间无显著差异，霍山石斛水提醇溶物组小鼠足肿胀值在各个时间点均低于空白组，但无显著性差异(P>0.05)；霍山石斛醇沉物组足肿胀度显著低于醇溶物组(P<0.05)，表明霍山石斛水提物中醇沉物具有抗炎作用，醇溶物未显现出抗炎作用。因此，课题组进一步分离了霍山石斛水提物中的醇沉物，继续寻找其抗炎有效部位。

图2 霍山石斛水提醇沉物与醇溶物抗炎作用

3.3 霍山石斛水提物醇沉物及多糖抗炎作用比较

多糖类物质不溶于乙醇，且霍山石斛中多糖含量较高，因此，课题组分离了醇沉物中的多糖类物质与醇沉物比较抗炎作用优劣。结果如图3。造模后空白组小鼠足肿胀度显著升高，表明造模成功。与空白组比较，霍山石斛水提物醇沉物组、多糖组、阿司匹林组在造模后1、2、4、8 h足肿胀值均显著降低(P<0.01或P<0.05)，且霍山石斛多糖组足肿胀度显著低于霍山石斛水提醇沉物组(P<0.05)；表明霍山石斛水提物中醇沉物、多糖均具有抗炎作用，多糖抗炎作用更佳。因此，霍山石斛多糖是霍山石斛抗炎的主要有效部位。

图3 霍山石斛水提醇沉物与多糖抗炎作用

3.4 霍山石斛多糖抗急性炎症作用研究

结果如表1。空白组小鼠足肿胀度、COX-2活性、组织PGE2、IL-1β、TNF-α水平显著升高，表明小鼠急性炎症模型成功。与空白组比较，霍山石斛多糖高、中剂量组、阿司匹林组足肿胀度显著降低，COX-2活性显著下降，组织PGE2、IL-1β、TNF-α水平显著降低(P<0.05)；表明霍山石斛多糖具有抗急性炎症作用。

表1 霍山石斛多糖对急性炎症小鼠的影响

4 讨论

炎症是机体受到损伤因子攻击时产生的一种防御反应，其病理过程包括变质、渗出、增生，由此引发局部的红、肿、热、痛及功能障碍。针对炎症的病理过程，研究人员用二甲苯致动物耳肿胀、冰醋酸致动物腹腔毛细血管通透性、角叉菜胶(蛋清)诱导动物足跖肿胀模拟人体炎症不同的病理阶段，用以评价药物的抗炎作用，已成为研究人员常用的经典抗炎药物筛选模型；其中角叉菜胶诱导的足肿胀模型常用于抗急性炎症的药物筛选。[18-19]因此，本课题采用足肿胀模型筛选霍山石斛抗急性炎症的有效部位。

中药传统用药方式是水煎煮，因此，本课题首先选用水提物与乙醇提取物进行抗炎作用比较，结果发现水提物显著降低小鼠足肿胀度，乙醇提取物组小鼠足肿胀度降低不明显。为此，继续探索了水提醇沉物与醇溶物对足肿胀小鼠的作用，结果发现水提醇沉物降低小鼠足肿胀度的效果优于醇溶物；霍山石斛水提醇沉物含多糖类物质较多，[19]因此，本课题将醇沉物去蛋白、柱层析分离精制霍山石斛多糖提取物(多糖类物质含量大于60%)，并与醇沉物比较抗炎作用，结果发现霍山石斛多糖降低足肿胀度效果优于醇沉物，表明霍山石斛多糖是霍山石斛抗炎作用的主要有效部位。

COX是炎症介质前列腺素生成的主要限速酶，药物可通过抑制COX-1、COX-2活性而达到抗炎作用；因COX-1是生理型，能促进胃肠、肾等器官发育，因此，COX无选择性抑制剂及COX-1抑制剂不良反应较多；[20-21]而COX-2是诱导型，在组织损伤、炎症等情况下表达增强，因此，COX-2迅速成为抗炎药物靶点，[22]但临床研究发现化药COX-2抑制剂可产生严重的心血管副作用，限制了其临床应用。[23]植物病原氧化酶与人体COX-2有极高的同源性，植物在受到病原体攻击时，其防御机制与哺乳动物相似。[24-25]因此，寻找天然衍生的COX-2抑制剂潜力无限。[26]为此，本课题基于抑制COX-2活性探讨霍山石斛多糖抗急性炎症疗效。结果发现，霍山石斛多糖可显著抑制COX-2活性，降低模型小鼠的足肿胀度。炎症状态下，TNF-α分泌量增加，可引起PGE2、IL-1β等炎症因子的瀑布式释放，[27-28]可促进机体炎症反应、组织损伤；[29]因此，降低IL-1β、TNF-α、PGE2等炎性介质释放，常作为评价药物抗炎活性的重要指标。[30]本课题研究发现霍山石斛多糖能降低小鼠足肿胀度，降低炎症因子IL-1β、TNF-α、PGE2的水平，抑制足肿胀小鼠COX-2活性，表明霍山石斛多糖具有较好的抗急性炎症效果。

霍山石斛多糖主要由葡萄糖、半乳糖、甘露糖等组成，[31]具体是哪种单糖或不同比例单糖发挥主要抗炎作用？有待于进一步深入研究。