人参皂苷Rg2对离体大鼠胸主动脉平滑肌的作用及作用机制研究

任 煜，刘婷婷，祁冰洁，祝凌丽

(安庆医药高等专科学校 科研中心实验室，安徽 安庆 246052)

高血压是恶性心脑血管事件的主要危险因素之一，脑卒中、心肌梗死、心力衰竭及慢性肾脏病是其主要并发症，严重威胁人类的身体健康，是医学界重点的课题之一。降压药物调节血压的途径有多种，包括影响交感神经，影响肾素血管紧张素系统(RAS)，调节钙通道，改善血管内皮功能，影响血液流变学，改变心脏血流动力学，抑制血管重构，利尿降压等。[1]临床治疗高血压的药物很多，但这些药物的靶点比较单一，都有其副作用，因此，发现安全有效的抗高血压药物具有重要意义。

人参是我国传统名贵中药材，对人体健康具有很重要的作用。人参中含有很多的生理活性物质，其中人参皂苷是迄今为止研究最多的活性物质，其中人参皂苷Rg2具有抗心肌缺血、改善失血性休克血流动力学、调节血压、改善脑缺血的作用。[2-4]近年来，越来越多的学者研究人参皂苷Rg2对心血管系统的影响。研究表明人参皂苷对于自发性高血压大鼠的有降压作用。[5]但人参皂苷Rg2具有舒张血管环的作用尚未见报道。因此，本研究采用离体血管环灌流方法，考察人参皂苷Rg2对离体大鼠胸主动脉平滑肌的舒张作用并探讨其作用机制，为筛选治疗心血管疾病治疗的天然药物提供实验基础。

1 材料

1.1 药品与试剂

人参皂苷Rg2(G-Rg2，成都曼思特生物有限公司)；去甲肾上腺素(NE，美国Sigma公司产品，批号：103K0979)；乙酰胆碱(ACH，美国Sigma公司产品，批号：BCBC9786V)；二甲基亚砜(DMSO，美国Sigma公司产品，批号：SHBC2107V)；左旋硝基精氨酸甲酯(L-NAME，美国Sigma公司产品，批号：BCBF4375V)，1H-[1，2，4]恶草灵并[4，3-a]喹喔啉-1-酮(ODQ，美国Sigma公司产品，批号：060M4102)；吲哚美辛(Indomethacin，美国Sigma公司产品，批号：030M1660V)；氯化钾(KCl，国产分析纯)；氯化钙(CaCl2，国产分析纯)。

K-H试液的为本课题组临用时自制：NaCl 118 mmol/L，KCl 4.7 mmol/L，NaHCO325 mmol/L，KH2PO41.2 mmol/L，MgSO41.2 mmol/L，CaCl21.3 mmol/L，d-glucose 10 mmol/L，纯水配制后，再充分通95% O2和5% CO2的混和气体后，用PH计测PH值，并滴定至PH7.4。

1.2 实验仪器

Maclab AID生物记录软件(ADInstrument，澳大利亚)；Radnoti组织器官灌流系统(ADInstrument，澳大利亚)。

1.3 实验动物

Wistar大鼠，雄性，体重250-300 g，清洁级，由中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供，批号：SCXK 200F(京)0004。

2 方法

2.1 大鼠胸主动脉环的制备

将大鼠端头处死后，迅速打开胸腔分离胸主动脉，立即投入4℃预冷的氧饱和Kreb-Henseleit(K-H)液中，小心分离周围组织后，剪成3-4 mm长的血管环。将处理好的动脉环置于含K-H液的37℃恒温浴槽中，一端固定于浴槽底部，另一端连接张力换能器，固定后调整动脉环张力至0.5 g，并不断通入95% O2和5% CO2的混合气体。用PowerLab /8P生物信号记录系统分析记录血管的等张收缩力，平衡15分钟。更换K-H液后，将张力维持在0.5 g的血管环的张力上调0.5 g，稳定15 min；重复换液并将张力继续上调0.5 g，直至达到血管环最佳静息张力2.0 g，在该条件下稳定90 min，进行后续实验。首先加入KCl溶液(终浓度为60 mmol/L)至浴槽，达到最大幅度后换液，加入K-H试液，平衡到2.0 g，稳定15 min。

2.2 血管环内皮完整性的检测

采用去甲肾上腺素(NE，终浓度为10-6mol/L)刺激血管环，使其张力上升至最大幅度，而后加入ACH(终浓度为10-5mol/L)，计算该血管环的舒张幅度，选择舒张幅度大于60%和小于10%的血管环进行后续预刺激收缩实验。

2.3 去内皮胸主动脉环的制备

取血管环，用玻璃棒轻轻碾压血管，以除去血管内皮。加入NE溶液(终浓度为10-6mol/L)至浴槽，使血管环收缩；待血管张力稳定后，加入Ach溶液(终浓度为10-5mol/L)使血管舒张。若血管环舒张幅度小于最大收缩幅度的5%，则可认为内皮去除完全，可用于后续试验。

2.4 累积浓度人参皂苷Rg2(G-Rg2)对内皮完整的离体胸主动脉的作用

采用NE刺激稳定后的离体血管环，使其稳定在最大收缩幅度，加入不同累积浓度的人参皂苷Rg2(G-Rg2终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)，对应给药时间点分别记为给药点1、2、3、4。用K-H营养液代替Rg2溶液外，其余操作步骤相同，作为空白对照组。采用肌张力换能器分别在给药点1、2、3、4上测定给药组与空白组的血管环张力，计算其舒张率：舒张率(%)=加入G-Rg2后血管环舒张幅度/NE诱发血管环的最大收缩幅度×100%。试验重复10次，记录并比较不同时间点各组的血管环舒张率。

2.5 累积浓度的人参皂苷Rg2对去内皮的离体胸主动脉的作用

将血管内皮除去后，按照2.4的方法，描记血管环张力曲线，并比较相同药物浓度对内皮完整与除去内皮的血管的舒缩活动的异同。

2.6 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对NO合酶抑制剂(L-NAME)、鸟苷酸环化酶抑制剂(ODQ)、环氧化酶抑制剂吲哚美辛(Indomethacin)预孵育的内皮完整的离体胸主动脉的影响

取2.4项下内皮完整的血管环，分别将NO合酶抑制剂L-NAME(终浓度为0.1 mmol/L)、鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ(终浓度为0.01 mmol/L)、吲哚美辛(Indomethacin)(终浓度为0.01 mmol/L)加入组织浴槽使之作用于稳定后的内皮完整的血管环，孵育20 min后，NE刺激血管收缩，当其稳定在最大幅度后，加入不同累积浓度的人参皂苷Rg2(G-Rg2终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)，描记张力曲线。用K-H营养液代替Rg2溶液外，其余操作步骤相同，作为空白对照组。再按2.4项下方法分别测定各给药组血管环张力并计算起舒张率。试验重复10次，记录并比较不同时间点各组的血管环舒张率。

2.7 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对NE所致的去内皮的离体胸主动脉收缩反应的影响

将去内皮的血管平衡在2.0 g，平衡15 min，待稳定后先加入累积浓度分别为3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L的去甲肾上腺素(NE)来收缩血管，作为空白对照，然后换液，平衡血管，将血管稳定在2.0 g，加入终浓度为10-3mol/L的Rg2，孵育血管20 min，用上述浓度的NE再次来收缩血管，描记张力曲线。分别测定各给药组血管环张力并计算起舒张率。试验重复10次，记录并比较不同时间点各组的血管环舒张率。。

2.8 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对KCl所致的去内皮的离体胸主动脉收缩反应的影响

将去内皮的血管平衡在2.0 g，平衡15 min，待稳定后先加入累积浓度分别为7.5 mmol/L、15 mmol/L、30 mmol/L、60 mmol/L的KCl来收缩血管，作为空白对照，然后换液，平衡血管，将血管稳定在2.0 g，加入10-3mol/L的Rg2，孵育血管20 min，用上述浓度的KCl再次来收缩血管，分别测定各给药组血管环张力并计算起舒张率。试验重复10次，记录并比较不同时间点各组的血管环舒张率。

2.9 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对CaCl2所致的去内皮的离体胸主动脉收缩反应的影响

将去内皮的血管平衡在2.0 g，平衡15 min，待稳定后，在高钾Krebs试液中，加入空白溶液孵育血管20 min，加入CaCl2溶液，使其终浓度分别为10-3mol/L、10-2.5mol/L、10-2mol/L、10-1.5mol/L，作为空白对照组，然后换液，将血管平衡到2.0 g，平衡15 min，换液3次，加入浓度为10-3mol/L的Rg2，孵育血管20 min，加入上述浓度的CaCl2再次来收缩血管，分别测定各给药组血管环张力并计算起舒张率。试验重复10次，记录并比较不同时间点各组的血管环舒张率。

3 统计学处理

实验数据以均值±标准差表示，采用SPSS23.0软件处理两组间均数比较作t检验，多组间均数比较作方差分析(ANOVA)采用单因素方差分析，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05表示差异显著，P<0.01为差异极显著。

4 结果

4.1 累积浓度的人参皂苷Rg2(G-Rg2)对于内皮完整及去内皮的离体胸主动脉的舒张作用

在内皮完整的情况下，人参皂苷Rg2(G-Rg2，终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)均能够降低血管环张力，与NE刺激下的最大张力比较，差异显著(P<0.01)。并且具有剂量依赖关系。但对于除去内皮的血管环，不同累积浓度的人参皂苷Rg2(G-Rg2)未能影响其张力，与空白对照组比较无明显差异(P>0.05)。表明不同浓度人参皂苷Rg2(G-Rg2)对内皮完整离体胸主动脉环有明显舒张作用，对去内皮的离体胸主动脉无明显作用，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)对血管的舒张作用呈内皮依赖性。结果见表1。

表1 人参皂苷Rg2对内皮完整与去内皮血管环张力的影响

4.2 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对NO合酶抑制剂( L-NAME)预孵育的内皮完整的离体胸主动脉的影响

人参皂苷Rg2(G-Rg2，终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)能够对内皮完整且采用L-NAME预孵育的血管环的舒张作用仍然存在，但与未加L-NAME组比较明显减弱，差异显著(P<0.01)，并且人参皂苷Rg2对去内皮血管无明显舒张作用。表明人参皂苷Rg2的血管舒张作用可能通过内皮依赖的NO-cGMP途径来实现的。结果见表2。

表2 人参皂苷Rg2对L-NAME干预条件下血管环舒缩活动的影响

4.3 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对鸟苷酸环化酶抑制剂(ODQ)预孵育的内皮完整的离体胸主动脉的影响

人参皂苷Rg2(G-Rg2，终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)能够对内皮完整且采用ODQ预孵育的血管环的舒张作用仍然存在，但与未加ODQ组比较明显减弱，差异显著(P<0.01)，并且对去内皮血管无明显舒张作用。进一步说明人参皂苷Rg2的血管舒张作用可能通过内皮依赖的NO途径来实现的。结果见表3。

表3 人参皂苷Rg2对ODQ干预条件下血管环舒缩活动的影响

4.4 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对环氧化酶抑制剂吲哚美辛(Indomethacin)预孵育的内皮完整的离体胸主动脉的影响

人参皂苷Rg2(G-Rg2，终浓度均为10-5、10-4、10-3、10-2mol/L)对内皮完整，并且采用Indom组预孵育的血管环的舒张作用与未加Indom组比较无显著差异(P>0.05)，并且对去内皮血管无明显舒张作用。表明人参皂苷Rg2的血管舒张作用可能不是通过内皮依赖的PGI2途径来实现的。结果见表4。

表4 人参皂苷Rg2对Indom干预条件下血管环舒缩活动的影响

4.5 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对NE所致的离体胸主动脉环收缩反应的影响

去除血管内皮，用累积浓度分别为3×10-8mol/L、10-7mol/L、3×10-7mol/L、10-6mol/L的去甲肾上腺素(NE)刺激血管收缩作为空白对照组。用终浓度为10-3mol/L的人参皂苷Rg2(G-Rg2)，孵育去内皮的血管20min，不同浓度的去甲肾上腺素(NE)与空白对照组相比，没有显著性差异(P>0.05)。表明人参皂苷Rg2(G-Rg2)的血管舒张作用可能不是通过抑制受体依赖性的钙通道来实现的。结果见表5。

表5 人参皂苷Rg2对NE所致的大鼠的离体胸主动脉收缩的收缩率的影响

4.6 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对KCl所致的离体胸主动脉环收缩反应的影响

去除血管内皮，用不同浓度的氯化钾刺激血管收缩作为空白对照组，用终浓度为10-3mol/L的人参皂苷Rg2(G-Rg2)孵育去内皮的血管20min。用终浓度为10-3mol/L的人参皂苷Rg2(G-Rg2)孵育后，不同浓度的KCl与空白对照组相比，在KCl浓度为15 mmol/L和30 mmol/L上显著性差异(P<0.01)。表明人参皂苷Rg2(G-Rg2)可能抑制电压依赖性钙离子通道，抑制细胞外钙进入血管平滑肌细胞。结果见表6。

表6 人参皂苷Rg2对KCl所致离体胸主动脉的血管环收缩的收缩率的作用

4.7 人参皂苷Rg2(G-Rg2)对CaCl2所致的离体胸主动脉环收缩反应的影响

去除血管内皮，在无钙的K-H试液中，用不同浓度的氯化钙刺激血管收缩作为空白对照组。用终浓度为10-3mol/L的人参皂苷Rg2(G-Rg2)孵育去内皮的血管20 min，用终浓度为人参皂苷Rg2(G-Rg2)10-3mol/L的Rg2孵育后，不同浓度的CaCl2与空白对照组相比，人参皂苷Rg2(G-Rg2)在CaCl2浓度为10-3、10-2.5、10-2、10-1.5mol/L上均出现显著性差异(P<0.01)。进一步表明人参皂苷Rg2(G-Rg2)可能抑制电压依赖性钙离子通道，抑制细胞外钙进入血管平滑肌细胞。结果见表7。

表7 人参皂苷Rg2对CaCl2以所致离体胸主动脉的血管环收缩的收缩率的作用

5 讨论

舒张血管的作用与血管内皮细胞和血管平滑肌细胞有关。[6]去甲肾上腺素(NE)能够选择性的激活血管平滑肌上的α1受体，开放受体操纵性钙通道(ROC)，细胞内钙离子增加使血管收缩。[7]NE能够激活磷脂酶C(PLC)，促使细胞内钙离子的释放。[8]本实验运用NE来收缩血管，作为血管收缩模型。ACH能够激活血管内皮细胞上的M受体，促进NO的释放，激活血管平滑肌细胞内NO-cGMP通路，引起血管是舒张。[9]因此本实验运用ACH来验证血管内皮的完整性。本研究发现，在血管内皮完整的情况下，人参皂苷Rg2(G-Rg2)对去甲肾上腺素收缩的离体血管具有舒张作用。血管内皮去除后，人参皂苷Rg2(G-Rg2)无舒张血管的作用。此研究表明，人参皂苷Rg2对NE收缩的血管舒张作用是内皮依赖性的。

血管内皮细胞能够调节血管张力，是最主要的结构。内皮细胞通过刺激释放各种各样的舒张血管因子来发挥舒张血管的作用。在大血管中，NO，PGI2作为主要的舒张血管因子。NO是血管内皮细胞上最强的血管舒张因子。[10]L-NAME作为一氧化氮合酶抑制剂，能抑制一氧化氮合酶的活性，减少NO的生成，抑制血管的舒张作用。NO-cGMP通路的关键酶是鸟苷酸环化酶，抑制鸟苷酸环化酶就是阻断了NO-cGMP通路，抑制血管的舒张。ODQ为鸟苷酸环化酶抑制剂，阻止了cGMP的生成，阻断了由NO-cGMP通路引起的血管舒张作用。前列环素(PGI2)也是血管的血管舒张因子，当血管内皮细胞受到外界的刺激后，环氧合酶(COX)氧化花生四烯酸生成不稳定的前列腺素(PG)G2和PGH2，(PG)G2和PGH2在血管内皮细胞内的前列环素合酶(PGIS)的作用下生成PGI2。[11]PGI2作用于血管平滑肌细胞，促进细胞内的cAMP的生成增多，导致血管的舒张。[12]环氧化酶是合成PGI2的关键酶，吲哚美辛是COX抑制剂，通过抑制环氧化酶，减少PGI2的生成，影响血管的舒张作用。本实验观察到，一氧化氮合酶抑制剂L-NAME、鸟苷酸环化酶抑制剂ODQ可以减弱人参皂苷Rg2(G-Rg2)对内皮完整的血管的舒张作用，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)舒张血管的作用可能与NO-cGMP途径有关。COX抑制剂吲哚美辛不能阻断人参皂苷Rg2(G-Rg2)的血管舒张作用，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)的血管舒张血管的作用可能不通过血管释放PGI2因子，引起血管的舒张。

血管平滑肌的收缩和舒张作用与细胞内钙的释放和细胞外钙的内流有关系，特别在心血管系统上，Ca2+是重要的信号分子与信使，开放钙离子通道，促进血管内皮细胞分泌舒张收缩因子等作用，[18]血管平滑肌上存在两种钙离子通道，即受体操纵性钙离子通道(ROCC)和电压依赖性钙离子通道(VDCC)。[13]受体操纵性钙通道是通过激动剂与膜上相应受体结合，使受体发生变化而其通道的开放，不同于电压依赖性钙离子通道，它不会因为膜电位的改变而发生改变，其开启是与磷酸肌醇的形成有关。在细胞膜上电压依赖性钙离子通道主要有T、L、N、P、Q、R六种类型的。而存在于血管上主要是L性钙离子通道，在高电压下的时候，L型钙离子通道容易被激活，尤其在膜电位达到通道-40mV时。开放后，细胞外的就会大量的内流，引起超极化，从而引起血管的收缩，其Ca2+内流持续时间较长。[14]钙离子通过这两个钙离子通道进入细胞内，引起血管收缩。NE能够开放受体操纵性钙通道(ROCC)，导致外钙内流，同时，NE能够与受体结合激活G蛋白，产生PIP3，引起内钙的释放，使平滑肌收缩。[15]氯化钾能够引起血管平滑肌细胞去极化，开放电压依棘性的钙通道，促进细胞外Ca2+内流，使细胞内Ca2+浓度增加，[16]而引起血管的收缩，流入细胞内的钙离子与内质网膜的雷诺丁受体结合，促进细胞内钙的释放，即钙诱导的钙释放。同时引起血管的收缩。[17]血管环在预加入钙鳌合剂EGTA的无钙的高钾的K-H液中孵浴后，细胞处于去极化的状态，电压依赖性的钙通道处于活化状态，再加入Ca2+，此时所引起的血管环收缩主要是细胞外钙通过钙通道流入细胞内所引起。[18]有研究表明，人参皂苷Rg2能够阻滞钙离子通道，减少Ca2+内流，对氧糖剥离/再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion，OGD/R)皮层神经元细胞具有保护作用。[19]在脑缺血缺氧，脑缺血再灌注时，Ca2+浓度在神经细胞内会异常升高，从而造成神经细胞损伤，人参皂苷Rg2可以阻断Ca2+通道，阻滞Ca2+的内流，缩短Ca2+通道开放时间、降低通道开放概率，减轻神经细胞的钙超载，对神经细胞损伤具有改善作用。[20]本研究观察到，人参皂苷Rg2(G-Rg2)不能舒张去内皮NE预收缩的血管环(p>0.05)，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)可能不阻断受体操纵型钙离子通道。人参皂苷Rg2(G-Rg2)能够舒张去内皮KCl预收缩的血管环(p<0.05)，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)可能阻断电压依赖性钙离子通道。为了证明人参皂苷Rg2(G-Rg2)是否作用于电压依赖性钙离子通道，血管环在预加入钙鳌合剂EGTA的无钙的高钾的K-H液中孵浴后，电压依赖性的钙通道处于活化状态，加入CaCl2，引起血管的收缩，观察发现，人参皂苷Rg2(G-Rg2)能够抑制去内皮CaCl2预收缩的血管环，说明人参皂苷Rg2(G-Rg2)可能抑制细胞外钙通过电压依赖性钙离子通道进入血管平滑肌细胞。

综上所述，人参皂苷Rg2(G-Rg2)具有良好的舒张血管的作用并且呈内皮依赖性，其机制可能与内皮依赖性环氧化酶途径和抑制电压依赖性钙离子通道的开放所导致的细胞外钙的内流有关。