阳江地区236例羊水地中海贫血基因的产前诊断＊

曾瑞华 许秀兰 黄平 曾昭珊

地中海贫血是常染色体隐性单基因遗传病[1]。轻型患者无症状，不影响日常生活工作，称为携带者，若与同型地中海贫血的携带者婚配、生育，根据地中海贫血遗传规律，将会有25%概率生育中型、重型地中海贫血患儿，需定期输血维持生命，严重影响患者的生存质量，甚至威胁生命，影响本地区的人口质量[2]。阳江地区位于粤西，人口200万，是地中海贫血高发区，广东省2012年大规模流调数据显示，携带同型地中海贫血基因的夫妇高达1.87%（这个是引用广东省2012年大规模流调的数据），如果不加予干预，每年将会有大量中重型地中海贫血患儿出生。阳江市妇幼保健院对怀孕中期携带同型地中海贫血基因的夫妇进行羊膜腔穿刺术，抽取羊水进行地中海贫血基因分析，查出重型地中海贫血患儿，终止妊娠，保障母婴健康，提高本地区人口素质，更好地完成出生缺陷防控工作。本研究统计分析了2019年6月-2021年4月阳江市妇幼保健院、阳西县妇幼保健院、阳江市江城区平岗医院、阳江市阳东区妇幼保健院抽取羊水检查的236例孕妇的临床资料，分析了阳江地区同型地中海贫血夫妇的羊水地中海贫血基因的产前诊断情况，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2019年6月-2021年4月于阳江市妇幼保健院、阳西县妇幼保健院、阳江市江城区平岗医院、阳江市阳东区妇幼保健院抽取羊水检查的236例孕妇的临床资料。纳入标准：（1）均具有平稳的生命体征；（2）均为单胎；（3）夫妻两人为同型地中海贫血。排除标准：（1）合并妊娠期并发症；（2）合并恶性肿瘤。年龄20～47岁，平 均（33.62±5.46） 岁； 孕 周 16～26周， 平 均（18.32±1.05）周。在孕妇类型方面，初产妇120例，经产妇116例。本研究通过医院医学伦理委员会批准，孕妇均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 标本采集 让孕妇适当活动，B超监护下经母腹实施羊膜腔穿刺术，选取髂前上棘和脐连线的中点处确定穿刺点，常规消毒腹部皮肤，铺洞巾，经皮用22G活检穿刺针，穿刺羊膜腔，抽取20 ml无菌羊水，分装在2支15 ml无菌离心管中送检。

1.2.2 DNA提取 标本送实验室进行DNA提取，具体操作为：抽取1管羊水，速率为2 500 r/min，离心10 min，每管留取0.5 ml羊水沉渣，接种在25 ml细胞培养瓶中并添加3.5 ml美国Gibco公司生产的Amnio Max培养液，放置在100%湿度、37 ℃、5% CO2培养箱中，1周后观察细胞生长情况。显微镜下见5、6个克隆细胞，每个克隆细胞含50～200个克隆羊水细胞，同时，在细胞克隆时，收获具有较强折光性、较多圆形分裂细胞。向15 ml无菌离心管中转移羊水细胞；另1管羊水离心10 min，速率为4 000 r/min，去除上清液，保留沉淀物（羊水细胞），向1.5 ml离心管中转移，应用离心柱型微量样品基因组DNA提取试剂盒（凯普有限公司）进行DNA提取，将蛋白酶K、细胞裂解液加入离心管中消化，向吸附柱转移裂解液，进行DNA洗脱。

1.2.3 DNA扩增 （1）运用Gap-PCR法检测α-缺失型地中海贫血--SEA/、-α3.7/、-α4.2/三种缺型。α-缺失型扩增程序：在96 ℃的温度下扩增5 min，在98 ℃、65 ℃、72 ℃的温度下分别扩增 45 s、90 s、3 min，共 10 个循环，在 98 ℃、65 ℃、72 ℃的温度下分别扩张 30 s、45 s、3 min，共 25 个循环，在 72 ℃的温度下扩增 10 min；（2）运用 PCR- 反向点杂交法对α-非缺失型、β-地中海贫血突变CD14-15、CD17、CD27/28、CD29、CD30、CD31、CD32、CD41-42、CD43、CD71-72、ⅠVS-Ⅱ-28、IVS-Ⅰ-1、IVS-Ⅰ-5、IVS-Ⅱ-654、Ⅰnt、βE、CAP、αWSα、αCSα、αQSα三种突变进行检测。α-非缺失型、β-地中海贫血突变扩增程序：在50 ℃、95 ℃的温度下分别扩增 15、10 min，在94 ℃、55 ℃、72 ℃的温度下分别扩增 60、30、30 s，共35个循环，在72 ℃的温度下扩增5 min；（3）采用PCR扩增仪（Hema 9600），应用地中海贫血基因检测试剂盒（深圳亚能生物技术有限公司）扩增。

1.2.4 电泳和杂交 （1）α-缺失型地中海贫血将2 μl扩增产物取出来，在5 V/cm电压下用含核酸染料的1.0%琼脂糖凝胶电泳1 h，在黑马凝胶成像系统上观察结果；（2）α-非缺失型、β-地中海贫血突变检测。在42 ℃的温度下在恒温水浴摇床上杂交1.5～4 h，洗膜，显色后观察结果。

1.3 观察指标

（1）观察阳江地区同型地中海贫血夫妇均为α-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果；（2）观察阳江地区同型地中海贫血夫妇均为β-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果。

1.4 统计学处理

本研究数据采用SPSS 17.0统计学软件进行分析和处理，计量资料用（±s）表示。

2 结果

2.1 阳江地区同型地中海贫血夫妇均为α-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果分析

236例中，夫妻双方均为α-地中海贫血168例，均为单胎，其胎儿重型α-地中海贫血22例，中间型α-地中海贫血29例，轻型α-地中海贫血60例，静止型α-地中海贫血22例，正常35例， 分 别 占 13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%，见表1。

表1 阳江地区同型地中海贫血夫妇均为α-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果分析

2.2 阳江地区同型地中海贫血夫妇均为β-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果分析

236例中，均为β-地中海贫血的夫妻68例，均为单胎，其中重型/中间型β-地中海贫血16例，轻型β-地中海贫血32例，正常20例，分别占23.53%、47.06%、29.41%，见表2。

表2 阳江地区同型地中海贫血夫妇均为β-地中海贫血的羊水地中海贫血基因的产前诊断结果分析

3 讨论

地中海贫血又称海洋性贫血或珠蛋白合成障碍性贫血，是常染色体隐性单基因遗传病[3]。由于珠蛋白链合成缺如或不足所导致的贫血或病理状态。缘于基因缺陷的复杂性与多样性，使缺乏的珠蛋白链类型、数量及临床症状变异性较大[4]。根据所缺乏的珠蛋白链种类及缺乏程度予以命名和分类。本病广泛分布于世界许多地区，东南亚即为高发区之一[5]。

基因珠蛋白链的分子结构及合成是由基因决定的。γ、δ、ε和β珠蛋白基因组成“β基因族”，ζ和α珠蛋白组成“α基因族”[6]。正常人自父母双方各继承2个α珠蛋白基因（αα/αα）合成足够的α珠蛋白链；自父母双方各继承1个β珠蛋白基因合成足够的β珠蛋白链[7-8]。由于珠蛋白基因的缺失或点突变，肽链合成障碍导致发病，根据缺失或者突变的基因数目多少导致贫血的程度又分为轻、中、重度贫血[9-12]。地中海贫血分为α型、β型、δβ型和δ型4种，其中以β和α地中海贫血较为常见[13-15]。

本研究结果表明，236例中，夫妻双方均为α-地中海贫血168例，其中诊断为重型α-地中海贫血22例，中间型α-地中海贫血29例，轻型α-地中海贫血60例，静止型α-地中海贫血22例，正常35例，分别占13.10%、17.26%、35.71%、13.10%、20.83%。均为β-地中海贫血的夫妻68例，其中重型/中间型β-地中海贫血16例，轻型β-地中海贫血32例，正常20例，分别占23.53%、47.06%、29.41%。据此能够将有效依据提供给终止妊娠与否，进而促进新生儿出生缺陷的降低，从而减轻家庭及社会的负担。

综上所述，阳江地区同型地中海贫血夫妇的羊水地中海贫血基因的产前诊断能够实现地中海贫血的早诊断，早干预，预防重型地中海贫血患儿的出生，减轻家庭及社会经济负担，提升人口素质。