KLF17、VGLL4在子宫内膜样腺癌中的表达水平与临床病理特征的相关性

陈海红 胡庆兰 蒋学风 罗志峰 刘海红

子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）是来源于子宫内膜的一组上皮性恶性肿瘤。每年有接近20万的新发病例，占全世界女性癌症病例的近5%，死亡人数的占比超过2%，是导致死亡的第三大常见妇科恶性肿瘤。子宫内膜癌的发病率、病死率上升，呈现年轻化趋势，严重威胁女性身体健康[1-2]。子宫内膜样腺癌是EC中最常见的病理类型，探索其致病机理，寻找预防、治疗子宫内膜样腺癌的新方法具有重要的临床意义。

上皮-间质转化（EMT）对于肿瘤细胞的作用是很重要的[3]。在Dong等[4]子宫内膜癌研究中，Kruppel样因子17（KLF17）通过反激活TWIST1来调节启动EMT而发挥致癌作用，KLF17在人子宫内膜细胞表达上调。

转录辅助因子退变样蛋白4（VGLL4）是转录增强因子（TEAD）的新伙伴，在子宫内膜腺上皮组织中有表达且起到肿瘤抑制作用[5]。基于此，本试验通过免疫组化法了解KLF17、VGLL4在子宫内膜样腺癌中的表达情况，分析KLF17、VGLL4在子宫内膜样腺癌中的病理差异性。

1 资料与方法

1.1 一般资料

2015年6月-2020年4月，从清远市妇幼保健院妇产科收集91例标本的临床资料。纳入标准：（1）术后经病理检查确诊；（2）术前未进行化疗、放疗或生物靶向治疗。排除标准：（1）合并其他恶性肿瘤；（2）艾滋病等累及免疫功能的疾病。其中22例为正常子宫内膜组织标本，28例经病理诊断为子宫内膜单纯性增生组织标本，41例为子宫内膜样腺癌组织标本。41例的子宫内膜样腺癌组织标本中，年龄35～72岁，中位年龄52岁。根据病理分化程度，高分化18例，中分化14例，低分化9例。根据2019年FIGO分期标准进行分类：34例Ⅰ、Ⅱ期和7例Ⅲ、Ⅳ期。肌层浸润深度＜1/2者30例，≥1/2者11例。包括：6例有淋巴结转移，35例无淋巴结转移。28例子宫内膜单纯性增生组织标本中，年龄30～69岁，中位年龄49岁，病程3～8个月，平均（5.64±0.61）个月；22例正常子宫内膜组织标本中，年龄36～70岁，中位年龄55岁。以上石蜡切片及病理标本均由2名病理专家重新阅片、复核证实。本研究符合伦理学标准，并通过清远市妇幼保健院伦理委员会批准。

1.2 方法

仪器：光学显微镜（XSP-C204）；成像系统；全自动LEICA免疫组化染色系统等。试剂：Rabbit anti-KLF17 antibody（ 武 汉 三 鹰 ）、Rabbit anti-VGLL4 antibody（abclonal）、免疫组织化学 S-P 检测试剂盒（servicebio）及DAB显色试剂盒（servicebio）。选取石蜡标本，连续切成厚4 μm的切片，所有切片均予防脱载玻片捞取标本，置于60 ℃烤片机烤片40 min以上，以防止脱片。严格按照试剂盒的说明，采用免疫组化学SP法进行脱蜡、水化、抗原修复、加一抗、孵育、加二抗、复染、阅片等步骤。试验阴性结果：PBS液代替一抗所得出的结果。试验的阳性对照：睾丸组织中KLF17阳性表达，胎盘组织中VGLL4阳性表达结果，显色为棕黄色。

1.3 观察指标及评价标准

KLF17、VGLL4主要表达于细胞核中；对每张载玻片随机选取10个高倍镜视野，观察染色强度并计分：分为0分（不存在）、1分（浅黄色）、2分（棕黄色）、3分（棕褐色）。计数染色阳性细胞占比及得分：分为0分（＜5%）、1分（5%～25%），2分（26%～50%）、3分（51%～75%）、4分（76%～100%）。IRS是染色强度得分和阳性染色细胞得分的总和（范围 0～7分），0～2分：-；3～4分：+；5～6分：++；7分：+++。其中 KLF17的IRS≥5分是高（阳性）表达，IRS≤4分是低（阴性）表达；VGLL4的IRS≥4分是高（阳性）表达，IRS≤3分是低（阴性）表达。

1.4 统计学处理

试验数据资料的归纳整理，本研究相关试验结果是运用SPSS 19.0进行统计。计数资料以率（%）表示，临床指标比较采用χ2检验，等级资料采用秩和检验，比较KLF17与VGLL4表达的相关性采用χ2检验及Spearman分析。检验标准是α=0.05；P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 KLF17与VGLL4在子宫内膜样腺癌、子宫内膜单纯性增生及正常子宫内膜组织中的表达

KLF17在子宫内膜样腺癌、子宫内膜单纯性增生、正常子宫内膜中阳性率分别占80.5%（33例）、25.0%（7例）、18.2%（4例），差异有统计学意义（P＜0.05）。VGLL4在子宫内膜样腺癌、子宫内膜单纯性增生、正常子宫内膜中阳性率分别占24.4%（10例）、71.4%（20例）、77.3%（17例），差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。

表1 KLF17和VGLL4在不同组织内膜中的表达

2.2 KLF17和VGLL4的表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征的相关性分析

KLF17在子宫内膜样腺癌中的阳性表达率在不同年龄组间、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌层浸润深度是否小于1/2、分化程度及有无淋巴结转移中比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。VGLL4在子宫内膜样腺癌中的表达阳性率在不同年龄组、FIGO分期（Ⅰ、Ⅱ及Ⅲ、Ⅳ）、肌层浸润深度是否小于1/2、有无淋巴结转移比较，差异无统计学意义（P＞0.05），而与分化程度有相关性，分化程度越高，表达越强（P＜0.05），见表2。

表2 KLF17和VGLL4的表达与子宫内膜样腺癌临床病理特征的关系（例）

2.3 VGLL4表达与子宫内膜样腺癌分化程度的相关性分析

在人子宫内膜样腺癌组织中，提示VGLL4表达与子宫内膜样腺癌分化程度存在正相关（r=0.346，P＜0.05），见表 3。

表3 VGLL4表达与子宫内膜样腺癌分化程度的相关性分析（例）

2.4 KLF17与VGLL4在子宫内膜样腺癌中表达的相关性分析

在人子宫内膜样腺癌组织中，KLF17表达与VGLL4表达存在负相关性（r=-0.437，P＜0.05），见表4。

表4 KLF17与VGLL4在子宫内膜样腺癌中表达的相关性（例）

3 讨论

子宫内膜癌是恶性上皮性肿瘤，高危因素有早初潮和晚绝经、不孕和不育、年龄增长、肥胖等。子宫内膜癌的发生与发展是由多种信号转导通路及基因异常相互作用的结果，是一组异质性的疾病[6-7]。KLF17作为激活剂或抑制剂发挥作用，取决于与不同的启动子及相互作用的结合蛋白，对肿瘤起到双向调节的作用，KLF17是子宫内膜癌上新发现的诱导EMT的因子。VGLL4可抑制EMT[8]。KLF17能够通过其锌指结构结合在靶基因富含G/C序列的启动子区，进而启动或抑制下游基因的表达[9]。本研究得出，KLF17与年龄、FIGO分期、肌层浸润深度、分化程度、淋巴结转移的比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。有研究中指出KLF家族的成员可以根据细胞和启动子环境来选择充当转录的激活剂或阻遏剂，或两者兼有[8]。KLF17的作用功能取决于启动子的功能及启动子所处的微环境。本研究中提示，KLF17在子宫内膜样腺癌组织中明显表达上调。KLF17作为跨膜丝氨酸蛋白酶corin（CRN）的转录调节因子，表达上调后参与妊娠子宫的调节和生理。因KLF17有反式激活的能力，在子宫内膜癌中是表达上调的。本研究与Dong等[4]研究中发现相一致，在KLFs家族中，KLF（1、4、5、10、13、16和17）在子宫内膜癌细胞系中显著上调，KLF（2、7、8、9、11、12、14和15）表达下调。KLF17通过结合TWIST1启动子反激活TWIST1。被激活的TWIST1通过直接抑制上皮标志物E-钙黏蛋白致多梳状蛋白-1（BMI-1）表达上调或TWIST1直接上调BMI-1的表达来促进EMT[10-11]。在Shen等[12]研究中指出：TWIST1的阳性表达：正常＜不典型增生＜Ⅰ型EC。与本文研究提示KLF17的阳性率呈递增趋势相一致。子宫内膜腺癌中高表达的TWIST1与KLF17结合，促进癌症的发生及发展。KLF17下调的情况在乳腺癌[13]、口腔癌[14]等研究中提示与癌组织TNM分期呈负相关，提示预后不良。本研究与临床病理特征无相关性，或许KLF17单纯的参与子宫内膜样腺癌的发生，或许是试验样本中病理类型较单一，子宫内膜样腺癌的预后良好，细胞分化良好，弱化其与临床病理特征的关联性，而标本数量相对较少及晚期病例不足等引起。

YAP作为原癌基因与TEAD结合，在Hippo通路中起到致癌作用。VGLL4作为体内YAP蛋白的抑制剂，竞争性结合TEAD，形成VGLL4-TEADs复合物，作用于Hippo途径的末端靶向转录机制，调控Hippo信号通路，达到有效地抑制肿瘤的形成和发展。有研究指出，VGLL4和YAP在调节肿瘤免疫中起到核心作用[15]。另外，VGLL4还作为人类胚胎干细胞存活的正调节因子[16]。基于上述理论基础，VGLL4在多种肿瘤中表达普遍下调，本试验研究通过免疫组化法检测VGLL4的表达，结果分析得出，VGLL4在10例（24.4%）病例中呈阳性，子宫内膜样腺癌组中VGLL4的阳性表达低于子宫内膜单纯性增生组，低于内膜正常组织中的表达。VGLL4阳性表达率与患者年龄、FIGO分期、肌层浸润深度、淋巴结转移的比较无相关性，与肿瘤的分化程度有关，分化程度越高，表达越强，差异有统计学意义（r=0.346，P＜0.05），这与Kim等[17]研究相似，Kim等[17]的研究中指出VGLL4在164例（55.6%）结直肠癌患者中呈阳性，肿瘤体积大小、pT分级高低、有无淋巴结转移均与其相关。有研究指出，YAP在子宫内膜癌中过表达与细胞增殖、侵袭和迁移显著相关[18]。TEAD在子宫内膜癌细胞中高表达[19]。在子宫内膜腺癌中，VGLL4表达下调，YAP表达上调，TEAD表达上调。下调的VGLL4的拮抗作用减弱，机体中YAP-TEADs复合物形成增多，同时VGLL4抑制YAP-TEADs复合物活性的作用减弱，促进肿瘤的发生及发展，与本研究结果相一致。有研究指出，VGLL4mRNA异常水平与胃肿瘤大小、肿瘤分期、淋巴管浸润和淋巴结转移呈负相关[20]，与本研究结果不相符，可能与本研究中晚期及复发性转移的标本量太少有关。VGLL4作为肿瘤抑制基因，在子宫内膜癌中表达下调。在正常子宫内膜、子宫内膜单纯性增生、子宫内膜样腺癌三组组织中，VGLL4的表达呈逐渐下降趋势，可能与内膜病变的发生发展有关。

随着子宫内膜样腺癌的相关研究越来越多，疾病的发生逐渐年轻化[21]。EMT是肿瘤发生过程中有重要作用。E-钙黏蛋白的丧失在EMT发生的不可或缺的事件之一。VGLL4过表达增加E-钙黏蛋白的表达水平并降低β-catenin的表达水平，部分可通过负调控Wnt/β-catenin信号传导途径抑制EMT，抑制癌症的侵袭及转移[22]。而TWIST1作为KLF17结合的启动子，直接抑制E-钙黏蛋白的表达诱导EMT促进癌症的发生及发展。E-钙黏蛋白的水平高低影响EMT的发生及发展。本试验结果表明：在33例KLF17阳性表达的人子宫内膜样腺癌标本中，有28例VGLL4表达阴性；在31例VGLL4表达阴性的人子宫内膜样腺癌样本中，有28例KLF17样本表达阳性，两者呈负相关性。两者在子宫内膜样腺癌中的作用有可能是相反的，这或许是相互作用，又或许是独立存在的因子。本试验研究显示，KLF17的表达在正常子宫内膜、子宫内膜单纯性增生、子宫内膜样腺癌三组组织中呈上调趋势，VGLL4的表达在正常子宫内膜、子宫内膜单纯性增生、子宫内膜样腺癌三组组织中呈下调趋势，这表明在癌变的过程中，内膜组织中KLF17、VGLL4发生变化。但本试验只反映出其变化的趋势，不排除有某种调节机制：KLF17、VGLL4对E-钙黏蛋白的表达水平的影响，从而影响子宫内膜样腺癌的发生过程，这只是其中一个方面，是否还有多个方面或机制联系KLF17、VGLL4参与子宫内膜样腺癌的发生，其具体变化需进一步完善更全面的试验和综合分析。在后续的试验研究中将加大临床病例数，搜集子宫内膜伴有不典型增生组织，增设试验分组，以及定量检测KLF17、VGLL4的表达水平，具体了解其在正常子宫内膜-子宫内膜单纯性增生-子宫内膜样腺癌发生轴中是否存在量的变化趋势，从而研究KLF17和VGLL4的表达水平与子宫内膜病变程度之间的关系。

综上所述，在子宫内膜样腺癌中，KLF17表达的上调和VGLL4表达的下调共同参与肿瘤的发生及发展，二者可能与内膜病变的发生发展有关。