基于网络药理学研究血府逐瘀汤治疗糖尿病肾病的作用机制

李桂女，李和教，黄 易，余 彬

（1.海南医学院第一附属医院，海口 570102；2.成都市第一人民医院，成都 610041；3.绵阳市中心医院，绵阳 621000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病常见并发症之一，属于微血管并发症，是由于长期高血糖导致代谢及其他功能紊乱而引起的肾小球硬化症[1]，临床表现主要为蛋白尿、水肿、高血压、肾小球滤过率降低，甚至进展为肾功能不全、尿毒症；DN是糖尿病主要的死亡原因之一，亦是增大糖尿病死亡风险的主要原因[2]；相对于单纯的糖尿病患者，DN患者的死亡风险是其12倍，不仅给患者的健康及心理带来严重的影响，还给社会及其家庭带来严峻的考验[3-4]。目前，西医在治疗DN上只能延缓疾病进一步发展，但并未治愈疾病本身，并且治疗过程中长期服用药物会导致药物依赖性、泌尿道及生殖系统出现感染等不良反应，治疗效果及患者死亡下降率尚未满意。因此，寻找治疗DN的新方法尤为迫切。

中药在治疗疾病的作用中体现多成分、多靶点及多通路等特点。研究[5]表明，中医中药在临床上治疗DN的效果显著，尤其在DN前期的治疗效果尤佳。中医认为DN发生发展的整个过程中会产生气阴两虚及血瘀，因此，治疗也应以益气养阴、活血化瘀为主[6]。血府逐瘀汤（口服液、胶囊）是治疗“胸中血府淤血”的常用理血药方之一，具有活血化瘀、行气通络之效，在临床上治疗DN具有较好的疗效，可过调节机体代谢、改善肾微循环、改善血流动力学紊乱与高凝状态及减少致病性细胞因子等改善DN患者临床症状[7-8]。但基础研究较少，血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点及机制尚不明确。本研究运用网络药理学方法，筛选血府逐瘀汤的活性成分靶点，构建“活性成分-潜在靶点”和“成分-潜在靶点-通路”网络，寻找潜在通路，从整体上对中药物质基础和药理作用进行系统和多层次的解析[9]，为更深入研究血府逐瘀汤治疗DN的潜在作用机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 血府逐瘀汤活性成分的筛选

以“桃仁、红花、当归、川芎、赤芍、牛膝、柴胡、桔梗、甘草、枳壳、地黄”为关键字，通过检索TCMSP数据库以及查询相关文献，收集符合口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug-likeness，DL）≥0.18条件[10]的活性成分，筛选血府逐瘀汤的活性成分，并且通过Pub－Chem数据查询活性成分对应的结构式（SMILES）。

1.2 血府逐瘀汤活性成分靶点反向预测

通过将SMILES依次输入Swiss数据库（http://www.swisstargetprediction.ch/）[11]中的Swiss，以“人类”为研究物种预测活性成分的靶点，整合去重得到血府逐瘀汤的作用靶点。

1.3 DN的靶点获取

利用“diabetic nephropathy”为关键词，对Gene Card数据库[12]进行疾病靶点的检索及筛选。整合去除重复靶点，即可获得DN的相关靶点。

1.4 构建活性成分-潜在靶点网络图

利用韦恩图（Venn diagram）得到成分靶点与疾病靶点的交集，即潜在靶点，使用Cytoscape 3.6.1软件构建活性成分-潜在靶点网络。网络图中的节点（node）分别为活性成分和潜在靶点；边（edge）表示三者的相互关系。使用Cytoscape中Network Analysis插件对相应网络进行拓扑性质分析，根据节点连接度（degree）和介数中心性（betweenness centrality）设置网络样式，节点大小反映degree大小，边的粗细反映betweenness centrality大小。

1.5 蛋白质相互关系网络构建和关键靶点筛选

将血府逐瘀汤治疗DN的潜在靶点导入String数据库，得到潜在作用靶点的PPI网络，结果以TSV格式导出，将结果中的node1、node2、combined score信息以TXT格式导入Cytoscape软件中进行可视化和Network Analyzer分析，以节点度值（degree）和介数中心度（betweenness centrality）大于等于所有点中位数值2倍的靶点，并满足接近中心度（closeness centrality）大于所有点中位数值条件筛选关键靶点作为血府逐瘀汤治疗DN的“关键靶点”，研究关键靶标可能存在的药理作用。

1.6 GO富集分析与KEGG通路分析

通过DAVID数据库对血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点进行Gene Ontology分析（生物过程、分子功能和细胞成分3个层面）和Pathways分析，保存并整理结果，筛选排名靠前的生物过程或信号通路，通过Omicshare进行可视化分析。

1.7 构建活性成分-潜在靶点-通路网络图

根据KEGG分析结果筛选出关键基因富集基因数相对较大的通路，通过Cytoscape软件构建活性成分-潜在靶点-通路网络图。

2 结果

2.1 血府逐瘀汤的活性成分筛选结果

通过TCMSP数据库以及文献分别检索血府逐瘀汤的活性成分及相应靶点等信息，满足OB≥30%和DL≥0.18条件的成分作为主要活性成分，共得到活性成分212个，其中桃仁23个、红花22个、当归2个、川芎7个、赤芍29个、牛膝20个、柴胡17个、桔梗7个、甘草23个、枳壳5个、地黄57个，去重及去除无结构式的活性成分后有105个活性成分，部分主要活性成分见表1。

表1血府逐瘀汤主要活性成分信息

2.2 构建血府逐瘀汤活性成分-血府逐瘀汤治疗DN的潜在靶点药理网络

活性成分-潜在靶点药理网络共包括202个节点和1 249个边，该网络包含了98个化合物节点和104个潜在靶点节点，见图1。潜在的活性成分与靶点产生1 436个相互作用关系。通过Network Analyzer对网络图进行分析，结果显示，与潜在靶点相互作用的活性成分中，橙皮素（Degree28）、木脂素（Degree27）、刺槐黄素（Degree27）、刺甘草查尔酮（Degree27）、汉黄芩素（Degree26）等与其他靶点连接度大于活性成分的中位数度值，即与6个以上靶点连接，是血府逐瘀汤治疗DN的主要成分；在这个网络中，药物活性成分可作用于相同的靶点，也可作用于不同的靶点，一种成分对应多个靶点，一个靶点也对应多种成分，这体现了其多成分、多靶点的作用特点。

图1 血府逐瘀汤的“活性成分-靶点”网络图

2.3 蛋白相互作用网络的构建和分析

使用STRING网站对得到的血府逐瘀汤治疗DN的潜在靶点进行分析，为获得更加简洁的PPI网络，首先删除自相作用关系的蛋白边，然后删除没有相互作用蛋白的节点，再使用Cytoscape软件构建潜在蛋白质-潜在蛋白质相互作用（PPI）网络，见图2。PPI网络中有104个节点和1 316个边缘。PPI网络图中节点的大小与其在网络中的度值呈正相关。节点的度值越大，其在网络中作用越重要，相应的蛋白质靶点在疾病过程中有着更重要的作用。而在PPI图中，用红色代表度值较大的关键蛋白，在PPI网络中白细胞介素（interleukin，IL）-6（Degree74）、TNF（Degree73）、GAPDH（Degree73）、AKT1（Degree70）、VEGFA（Degree62）、IL-1B（Degree62）、IL-2（Degree38）、MMP9（Degree50）、MMP2（Degree39）、STAT1（Degree36）蛋白质节点的程度较高，大于节点中位数对应的度的2倍以上，这些靶点蛋白可能在DN的发展中起关键作用，见表2。

图2 血府逐瘀汤治疗DN潜在靶点相互作用网络图

2.4 生物通路富集分析

使用DAVID网站对血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点进行GO富集分析，得到P<0.05的富集GO条目共计109个，其中包含生物过程条目共74个，最显著的为ERK1和ERK2级联正调控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正调节、GTP酶活性的正调控等；细胞组成分析结果共有13条，最显著的为核质、细胞外间隙、胞外区、细胞质核周区等；分子功能分析结果共有22条，最显著的为酶活性、ATP结合、细胞因子活性、转录因子活性、DNA结合等，各类分别取前20条。通过对血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点进行KEGG通路分析得到P<0.05的通路共76条，包括JAK-STAT信号通路、缺氧诱导因子1（HIF-1）信号通路、Toll样受体信号通路、肿瘤坏死因子（TNF）信号通路、FoxO信号通路、雌激素信号通路等，见图3。此20条作用通路均与血府逐瘀汤治疗DN相关的8个以上靶基因富集重叠，揭示血府逐瘀汤的有效成分可能通过作用于以上多条信号通路来治疗DN。相关通路信息及富集基因，见表3。

图3 GO富集分析和KEGG富集分析气泡图

表2血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点

2.5 构建血府逐瘀汤活性成分-潜在靶点-通路网络

为研究血府逐瘀汤治疗DN的主要作用通路，本研究将血府逐瘀汤治疗DN作用的35个关键靶点蛋白置入DAVID数据库中进行通路富集分析，删除结果中含有特殊疾病信号通路，并将结果在Cytoscape软件中构建血府逐瘀汤活性化合物-疾病靶点-通路网络，见图4。该网络共有127个节点和289个边，该网络有77个血府逐瘀汤中的化合物，27个主要的DN潜在靶点和13个通路。其中TNF信号通路有8个关键靶点富集、JAK-STAT信号通路有4个靶点富集、HIF-1信号通路有8个蛋白富集、Toll样受体信号通路有10个蛋白富集、胰岛素抵抗和FoxO信号通路有9个蛋白富集，其余通路富集蛋白数量见表3。

图4 血府逐瘀汤治疗DN的“活性成分-靶点-通路”网络图

表3 KEGG富集通路条目信息

3 讨论

中医认为，DN属于“消渴证”“尿浊证”范畴，属于“水肿”和“消渴”类型，肾是主要病位，主要累及脉络、脾和肝。血府逐瘀汤中的成分有甘草、生地黄、牛膝、桔梗、枳壳、柴胡、红花、赤芍、桃仁、川芎和当归。赤芍、川芎和当归不仅可以起到养血疗效，还可以活血化瘀；赤芍、枳壳和柴胡主要疗效为疏肝理气；川芎、当归、红花、生地黄和桃仁不仅可以养阴润燥，还能活血化瘀。一般可以通过调节机体代谢和改善微循环来发挥活血化瘀对于DN的防治作用。各种药物一起使用，则可以有效通畅气血、疏通血脉，起到消肿的疗效。DN的生理病理机制十分复杂，越来越多的现代药理学研究显示其可能跟炎性因子、糖脂代谢紊乱、血流动力学改变、氧化应激及遗传因素等多方面[13-14]有关，共同参与了DN的发生与发展过程。

3.1 血府逐瘀口服液的中药化学成分靶标分析

在血府逐瘀汤治疗DN的成分靶点网络中，包括103个活性成分和104个潜在主要靶点，其中有28个化合物能与20个及以上靶点发生相互作用，包括山柰酚（kaempferol）、黄芩黄素（baicalein）、刺甘草查尔酮（glypallichalcone）、刺槐黄素（acacetin）、木犀草素（luteolin）、汉黄芩素（wogonin）、表小檗碱（epiberberine）。槲皮素具有抗炎、抗氧化等作用，对糖尿病并发症如DN、视网膜病变等具有较好的疗效[15]，还可通过抑制糖尿病肾脏的氧化和糖化来控制糖尿病并发症[16]。与槲皮素化学结构类似的山柰酚具有降空腹血糖、改善胰岛素抵抗、调节糖脂代谢紊乱、抗氧化应激和炎性反应等作用[17-18]。查尔酮类可通过抑制相关蛋白及基因的表达（p22phox、p47phox mRNA）、转录及翻译，降低还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶的活性，减轻肾脏氧化应激程度。在临床治疗中，中药与西药相比，其治疗疾病的作用机制更为复杂，但毒性较小，DN发病机制主要是高血糖所引起的肾脏血流动力学变化、氧化应激、肾组织炎性反应增加等。血府逐瘀口服液作用原理主要是通过调节机体代谢、改善肾微循环、改善血流动力学紊乱与高凝状态及减少致病性细胞因子等治疗DN。

3.2 血府逐瘀汤治疗DN的核心靶标分析及关键通路分析

本研究通过构建“活性成分-靶点”网络及对相关的通路进行分析，探讨血府逐瘀汤治疗DN的关键靶点及其作用机制。对“成分-靶点”网络图进行拓扑分析潜在靶点，推测血府逐瘀汤的活性成分主要通过作用于MAPK8、STAT1、IL-2、MMP2、MTOR、SIRT1、ESR1、MMP9、STAT3、IL-1B、VEGFA、AKT1、TNF、IL-6等关键基因上发挥调控DN的发生发展过程。

通过DAVID数据库对关键靶点进行GO和KEGG富集分析，GO富集和KEGG通路富集结果显示，关键靶点主要富集于TNF信号通路、JKA-STAT信号通路、雌激素信号通路、HIF-1信号通路等，涉及ERK1和ERK2级联正调控、蛋白磷酸化、MAP激酶活性的正调节等生物过程。炎性因子介导的微炎环境与DN的发生发展存在紧密关系[19]，产生了极大影响。研究发现，IL-1B、IL-6及TNF等炎性因子参与DN病情发生及进展并直接与患者的蛋白尿程度相关[15]，通过引起肾小球基底膜厚度增加而加速了2型糖尿病患者终末期肾病的病情进展[16-17]。这说明改善或抑制DN患者机体微炎环境（抑制炎症因子的分泌等）可影响及优化DN患者的预后和治疗效果。丝裂原活化蛋白激酶，即MAP酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）参与调控细胞代谢凋亡及基因表达等效应，活化后的p38MAPK可通过多种途径参与细胞应激、炎性反应和凋亡，进一步促进DN的发生、发展[18，20]；抑制p38MAPK表达水平可以明显减少DN的蛋白尿，减轻巨噬细胞、T细胞的浸润和炎性介质的释放，最终延缓DN的进展、降低氧化应激损伤、抑制肾脏组织细胞凋亡、降低炎性介质水平，对2型糖尿病大鼠肾脏组织起保护作用。而细胞外信号调节激酶1/2（extracellular regulated protein kinase 1/2，ERK1/2）是MAPK家族最主要成员，主要参与细胞的生长、发育、分裂、凋亡等多种生理反应的过程，是胞内介导胞外刺激的重要信号系统之一[21]。激活ERK1/2信号通路可诱导足细胞损伤、肾间质炎症及纤维化等，参与DN的发生发展[22]。也证实ERK1/2信号通路激活可促进肾脏系膜细胞增殖，进而导致肾小球的硬化。

JAK2/STAT3信号途径参与了多种重要致炎/抗炎细胞因子包括肿瘤坏死因子（TNF）、IL-1等的信号转导及基因调控过程[23]，可诱导细胞凋亡，引起肾组织的免疫炎症性反应，通过氧化应激与糖脂代谢交叉调控进而引起糖代谢紊乱[24]；有实验证明[25-26]，糖尿病大鼠肾小球及系膜细胞中JAK/STAT途径活性明显增强，相关蛋白表达水平升高，而活化的JAK2/STAT3信号通路可进一步刺激细胞外基质合成及肾小球系膜细胞增殖，最终导致肾损伤；抑制JAK/STAT信号通路及其调控的炎症因子及纤维化相关蛋白的活化与表达，从而对DN的进展起到延缓作用[27]。由此可见，血府逐瘀汤有效活性成分可能通过参与调控血浆黏稠程度、血清总胆固醇等血液流变学保护肾脏，通过细胞凋亡有效清除大量的增生细胞，进而对肾脏功能给予有效保护。

本研究通过网络药理学方法初步探讨了血府逐瘀汤的化学成分，治疗DN的关键靶点、关键通路，并进行了预测分析，为后期研究其治疗DN的机制提供参考，为其临床治疗DN提供理论依据，但其具体的机制还需通过体内和体外实验来进一步确证。