右美托咪定预处理对脓毒症急性肾损伤大鼠肾功能的影响

周文杰，杨海荣，张 楠，刘勤富，马希刚

（1.宁夏医科大学总医院重症医学科，银川750004；2.宁夏医科大学附属自治区人民医院，银川750021；

3.宁夏医科大学总医院手术室，银川 750004）

脓毒症是引发脓毒症休克和多器官功能障碍综合征的重要因素[1]。脓毒症相关急性肾损伤（acute kidney injury，AKI）具有病情危重、死亡率高、预后差、易发展为慢性肾脏病等特点[2-3]，对患者和社会是沉重的负担。脓毒症相关AKI是一种涉及炎症、肾毒性、缺血性损伤等多因素的综合征，致病机制复杂，目前尚无有效的预防或干预药物[4]。因此，寻求有效减轻脓毒症相关AKI的治疗药物对于改善预后尤为重要。右美托咪定（dexmedetomidine，DEX）是一种新型α2肾上腺素受体激动剂，具有镇静镇痛、抗焦虑、抗氧化应激、抗炎等作用[5-6]。但DEX预处理是否对脓毒症AKI具有保护作用尚不清楚。本研究通过盲肠结扎穿孔（CLP）法制备大鼠脓毒症AKI模型，探讨DEX预处理对脓毒症AKI的保护作用，为临床治疗脓毒症AKI患者提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物与分组

健康雄性SD大鼠60只，体质量（250±20）g，购于宁夏医科大学实验动物中心，动物合格证号：SCXK（宁）2015-0001。按照随机数表法分为4组：假手术（Sham）组、DEX对照组、盲肠结扎穿孔（CLP）组、DEX干预组，每组15只。

1.2 大鼠脓毒症模型制备

采用CLP法制备大鼠脓毒症AKI模型。即称重后腹腔注射10%水合氯醛0.35 mL/100 g充分麻醉大鼠，于腹部行1.5 cm切口，开腹分离出盲肠，在盲肠根部用3.0丝线结扎，避免结扎回盲瓣，在盲肠被结扎段避开血管，用直径2.6 mm的三棱针穿刺3孔，挤出少量粪便后回纳腹腔，分层关腹。Sham组和DEX对照组仅开关腹，不结扎，不穿孔。术后皮下注射复方氯化钠3 mL/100 g补液，保暖复温后放回鼠笼，自由进食水。各组分别于术后6、12和24 h处死5只大鼠取材待测。本实验中所有动物处理方法符合动物伦理学标准，并通过宁夏医科大学总医院医学科研伦理审查委员会批准（审批号：2019-228）。

1.3 DEX干预措施

采用预处理的方法进行干预。1）DEX对照组和DEX干预组：制模前1 h经尾静脉持续泵入右美托咪定（江苏恩华，批号：H20110085），速率为5 μg·（kg·h）-1，泵注时间为1 h；2）Sham组和CLP组：制模前1 h经尾静脉泵入等体积生理盐水。

1.4 标本收集

各组术后6、12和24 h分别取5只大鼠，沿腹中线打开腹腔，经腹主动脉采血3~5 mL，以3 000 r·min-1速度、4℃离心15 min分离血清，存于-80℃冰箱备用。打开后腹膜，分离左侧肾脏，去除包膜，沿肾横轴切取厚约3 mm组织置于4%多聚甲醛中固定，待行病理形态学观察。同时在左肾皮髓质交界区切取大小为1 mm×1 mm×2 mm组织置于2%戊二醛中固定，待行电镜观察超微结构。

1.5 检测指标

1.5.1 肾组织病理形态学检测 将肾组织于4%多聚甲醛中浸泡固定24 h，二次取材后置于包埋盒中，流水冲洗3 h，70%乙醇过夜，经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋后切片，厚度4 μm，进行苏木素-伊红（HE）染色。切片置于光镜下观察肾组织病理形态，并参照文献[7]对肾小管损伤程度进行评价。据损伤程度按以下标准进行半定量评分：无损伤为0分；≤25%为1分；26%～50%为2分；51%～75%为3分；>75%为4分。

1.5.2 肾组织超微结构观察 将肾组织置于2%戊二醛中固定2 h，0.1 mol·L-1二甲胂酸钠缓冲液冲洗，每2 h更换一次，1%锇酸浸泡2 h，每15 min更换一次缓冲液，共冲洗2次，30%~100%乙醇依次脱水，环氧丙烷渗透，包埋组织，制作切片，在透射电镜下观察肾组织超微结构。

1.5.3 血清肌酐（Cr）和尿素氮（BUN）检测 腹主动脉采血后离心分离血清，采用全自动生化分析仪（日立7180型）检测血清Cr和BUN水平。

1.5.4 血清中性粒细胞明胶酶相关脂质运载蛋白（NGAL）和肾损伤分子-1（KIM-1）的检测 采用酶联免疫吸附试验（ELISA）法测定血清NGAL和KIM-1水平。各组大鼠腹主动脉采血制备血清，标准孔加标准品50 μL，样品孔加样品稀释液40 μL及待测样品10 μL，37℃温育1 h，洗涤5次后避光显色15 min，终止反应，在450 nm波长测量各孔的吸光度（OD）值。根据ELISA试剂盒中提供标准品做出标准曲线，测出每个样品吸光度OD值，代入标准曲线中，计算得出样本浓度值。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用SNK-q

检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肾组织病理形态学观察

光镜下可见Sham组和DEX对照组各时间点肾组织结构完整，未见明显病理学改变。CLP组可见肾小球水肿瘀血，有核细胞数增多；肾小管上皮细胞空泡变性，部分刷状缘丢失，肾小管扩张，部分有管型，肾间质水肿、灶性出血；CLP术后6 h损伤程度最轻，随术后时间延长，损伤呈加重趋势，至24 h最为显著。DEX干预组各时间点肾损伤程度较CLP组均减轻，见图1。

图1 各组大鼠肾组织病理形态学改变（HE×400）

2.2 各组大鼠术后不同时间肾小管损伤评分比较

各组大鼠术后不同时间肾小管损伤评分，Sham组和DEX对照组间差异无统计学意义（P>0.05）；CLP组术后各时间点肾小管损伤评分均高于Sham组（P均<0.01），DEX干预组各时间点肾小管损伤评分均较CLP组降低（P均<0.01），见表1。

表1各组大鼠术后不同时间肾小管损伤评分（±s，分）

表1各组大鼠术后不同时间肾小管损伤评分（±s，分）

与Sham组比较aP＜0.01；与CLP组比较bP＜0.01。

组别 12 h 24 h Sham组 0.39±0.18 0.42±0.20 DEX对照组 0.38±0.16 0.39±0.24 CLP组 2.62±0.34a 3.52±0.34a DEX干预组 1.34±0.26ab 2.08±0.38ab n 15 15 15 15 6 h 0.36±0.25 0.34±0.24 1.98±0.37a 0.66±0.27ab

2.3 各组大鼠术后不同时间肾组织超微结构观察

透射电镜下显示，Sham组和DEX对照组肾小球结构正常，足细胞结构正常，细胞器完整，足突排列整齐、无倒伏或融合、裂孔清晰，基底膜厚薄均匀。近曲小管结构正常，上皮细胞核膜清晰，线粒体数目丰富、形状规则、嵴清晰。CLP组可见肾小球结构局部损伤，肾小管损伤较肾小球更明显。6 h见足细胞结构尚正常，足突肿胀呈矮柱状，有轻微融合，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮可见空泡变性，线粒体肿胀，界限不清，部分嵴溶解。12 h损伤进一步加重，足突局灶性倒伏、融合，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮细胞可见较多大空泡，线粒体数量减少、嵴溶解加重。24 h足细胞细胞器轮廓不清，足突倒伏、融合程度加重，裂孔模糊不清，基底膜厚薄不均；近曲小管上皮核固缩，线粒体损伤加重，部分空泡化。DEX干预组6 h肾小球及肾小管结构基本正常，12 h肾小球可见足突有轻微融合，肾小管线粒体肿胀，部分嵴溶解。24 h可见足突局灶融合，基底膜基本均匀；肾小管核膜清晰，线粒体致密、嵴溶解，见图2。

图2 透射电镜下各组大鼠肾小球和肾小管超微结构改变（肾小球×5 000，肾小管×100 000）

2.4 各组大鼠术后不同时间血清Cr和BUN水平的变化

血清Cr和BUN水平在6 h各组间差异均无统计学意义（P均>0.05）。CLP组于12 h、24 h的血清Cr和BUN水平均高于Sham组（P均<0.01）；DEX干预组12 h和24 h的Cr及BUN水平均低于CLP组（P均<0.01）。Sham组与DEX对照组各时间点Cr和BUN水平差异均无统计学意义（P均>0.05），见表2。

表2各组大鼠术后不同时间血清Cr和BUN水平的变化

2.5 各组大鼠术后不同时间血清NGAL和KIM-1水平的变化

CLP组大鼠血清NGAL和KIM-1水平在6、12和24 h均高于Sham组（P均<0.01）；DEX干预组大鼠血清NGAL水平在6 h和12 h，KIM-1在6、12和24 h均高于Sham组（P均<0.01）；DEX干预组大鼠血清NGAL和KIM-1水平在6、12和24 h均低于CLP组（P均<0.01）。Sham组与DEX对照组各时间点NGAL和KIM-1水平差异均无统计学意义（P均>0.05），见表3。

表3各组大鼠术后不同时间血清NGAL和KIM-1水平的变化

3 讨论

CLP法制模大鼠术后精神萎靡，少食懒动，寒颤、蜷缩、竖毛，眼角及鼻腔可见淡血性分泌物，腹胀腹泻，上述表现随术后时间延长而逐渐加重，处死大鼠开腹可闻及恶臭，有较多淡血性浑浊腹腔积液，结扎段盲肠扩张坏死明显，呈紫黑色，与周围组织粘连严重，表明脓毒症模型复制成功。同时，Sham组和DEX对照组探查膀胱充盈、尿液清亮，CLP组大鼠膀胱挛缩无尿，且部分膀胱内可见白色结晶，而DEX干预组膀胱充盈欠佳、尿色深，大鼠尿量的变化符合临床脓毒症AKI的特点。同时检测脓毒症组大鼠血清NGAL和KIM-1在肾损伤早期已明显升高，血清Cr和BUN反映早期肾损伤有较大的局限性，但随时间延长出现持续上升趋势。并且CLP组出现肾损伤的病理改变，且肾小管损伤评分升高。综合尿量、肾损伤标记物及肾脏病理学改变的情况，证实脓毒症诱发了AKI[8]。

脓毒症患者中AKI发病率高，同时与患者病死率增加独立相关[9]。肾小管上皮细胞凋亡已被认为是脓毒症AKI的显著特征，与患者肾功能恶化及死亡率增加密切相关[10]。氧化应激、炎性反应、缺血等均可造成细胞凋亡[11-12]。本研究在光镜下观察到CLP组大鼠肾组织水肿、间质灶性出血，可以明显见到肾小管的损伤，诸如空泡变性、刷状缘丢失、肾小管扩张、管型形成等改变，同时在电镜下证实了小管上皮细胞中有线粒体的损伤，同时出现核固缩、上皮细胞凋亡现象。足细胞是维持肾小球滤过屏障的重要结构，本研究在透射电镜下还观察到了肾小球的损害，主要以足突局灶性倒伏融合为主，其形态改变会增加滤过屏障的通透性，导致肾功能恶化[13]，说明脓毒症发生时，以炎性反应为关键环节，同时伴随氧化应激、局部缺血损害、能量代谢障碍等过程，不仅破坏肾小管上皮细胞的正常结构，诱发细胞凋亡，同时还损害肾小球滤过屏障的正常结构，最终导致急性肾损伤。在给予DEX预处理后，大鼠肾小管及肾小球的病理改变均明显减轻，血清Cr、BUN和NGAL、KIM-1的水平也有所下降，说明对脓毒症AKI具有一定的保护作用。

DEX激动α2肾上腺素能受体具有高选择性和特异性，不仅应用于镇痛镇静领域，近年来，其器官保护作用也成为研究热点。有研究[14-15]显示，DEX具有抑制炎性反应、抗氧化应激、免疫调节等作用，对脑、心脏、肺、肾、肠等器官具有保护作用，但其具体机制仍在进一步研究中。在脓毒症诱发的急性肺损伤小鼠模型中，DEX能通过上调TIPE2并抑制NF-κB和JNK信号通路的激活，减轻肺组织炎性反应和细胞凋亡，从而对急性肺损伤起到保护作用[16]。本实验中给予DEX预处理后各时间点大鼠肾损伤程度均减轻，肾功能得到改善，提示DEX对脓毒症大鼠AKI有一定的保护作用，其保护机制可能与抑制炎性反应及细胞凋亡，降低肾小球屏障的通透性有关。

综上所述，DEX预处理可以减轻脓毒症AKI大鼠肾功能，有望成为临床治疗脓毒症AKI的有效药物，其具体机制仍需进一步研究。