基质金属蛋白酶-7、9基因多态性与卵巢癌遗传易感性的相关性研究

胡 鹏，朱小鹏

（鄂东医疗集团黄石市中心医院，湖北理工学院附属医院腹盆肿瘤内科，黄石 435000）

卵巢癌是女性较为常见的生殖器官恶性肿瘤，2018年全球的卵巢癌新发病例数约为30万，占恶性肿瘤的1.6%，而死亡病例数约为18万（1.9%），并且发病率和死亡率呈逐年增长趋势，对女性健康造成严重威胁[1]。单核苷酸多态性是基因变异的常见形式，每1 000个核苷酸即存在1个单核苷酸多态性位点，与肿瘤的发生联系密切[2]。基质金属蛋白酶-7（MMP-7）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）均属于MMP家族成员，其表达异常与卵巢癌的发生密切相关[3-4]。rs138970782位点和rs3918255位点分别位于MMP-7和MMP-9上，其对卵巢癌发生发展的影响仍缺乏研究。本研究检测卵巢癌患者MMP-7和MMP-9的基因多态性，旨在探讨二者基因多态性与卵巢癌遗传易感性的关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象

选择2018年2月至2020年12月在鄂东医疗集团黄石市中心医院接受治疗的90例卵巢癌患者作为研究对象，并将其纳入卵巢癌组。选择同期在本院接受体检的90名健康体检者作为对照组。卵巢癌组年龄45~66岁，平均年龄（52.34±4.34）岁，其中包括低分化42例、中分化29例以及高分化19例。FIGO分期Ⅰ期31例，Ⅱ期14例，Ⅲ期36例，Ⅳ期9例。对照组年龄45~66岁，平均年龄（52.34±4.34）岁，研究对象对本研究具有知情权并签署知情同意书，本研究获本院伦理委员会的同意。纳入标准：1）卵巢癌患者经过病理学诊断确诊；2）临床相关资料完整；3）预计生存时间超过3个月。排除标准：1）合并除卵巢癌外的其他肿瘤者；2）有放化疗治疗史者；3）接受卵巢癌根治术者。

1.2 主要试剂与仪器

10×Takara buffer购自美国Takara生物科技有限公司（货号：9151N）。虾碱酶（shrimp alkaline enzyme，SAP）购自哈尔滨新海基因检测有限公司（货号：C4901A，规格：500 U）。血浆DNA抽提试剂盒购自美国默克生命科技有限公司（货号：NA2010-1KT）。ABI PCR仪购自美国ABI科技有限公司（型号：ABI9700）。引物均由苏州金唯智生物科技有限公司进行合成。核酸外切酶Ⅰ（exonucleaseⅠ，ExonⅠ）购自美国赛默飞世尔生物科技有限公司（货号：EN0581，规格：4 000 U）。Snapshot mix购自美国ABI科技有限公司（货号：4323154）。

1.3 研究方法

1.3.1 样本收集 采集患者晨起空腹血液4 mL于抗凝管中，2 500 r·min-1离心10 min分离血浆。采用血浆DNA抽提试剂盒对血液中的DNA进行抽提，操作流程严格按照试剂盒说明书进行。

1.3.2 MMP-7和MMP-9基因产物PCR采用Snapshot技术进行MMP-7和MMP-9基因分型。PCR扩增包含MMP-7的rs138970782位点及MMP-9的rs3918255位点的DNA片段，MMP-7上游引物序列为5’-AGTGCGACACGCCCACCATA-3’，下游引物序列为5’-CGTGCGCGTACGGG TTTCTTTCA-3’。MMP-9上游引物序列为5’-TGGTACGCTGTCCTCAATGG-3’，下游引物序列为5’-TTCAAGGCAGGGAAGCATCGTGA-3’。PCR体系：4.13 μL水，1 μL的10×Takara buffer，1.2 μL的dNTP，0.6 μL的MgCl2，上下游引物各1 μL、0.07 μL的Takara Taq，1 μL的DNA（20 ng·μL-1），体积总共10 μL，PCR产物大小为200 bp。PCR反应使用ABI PCR仪进行，PCR条件：95℃2 min，（94℃20 s，65℃40 s，72℃1.5 min）×11，（94℃20 s，59℃30 s，72℃1.5 min）×24，72℃2 min，16℃∞。PCR产物用SAP和ExonⅠ进行纯化，纯化体系：10 μL PCR产物中加入1.5 μL的SAP（1 U/μL）和0.5 μL的ExonⅠ。反应条件：37℃30 min，65℃10 min。延伸反应：延伸引物分别用MMP-7-rs138970782-G：5’-GGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGACC TGCTCAGTAAGTGACCATTCG-3’和MMP-7-rs138970782-A：5’-GGGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGG G GGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGAC C GCTCAGTAAGTGA CCATTCA-3’；MMP-9-rs3918255-C：5’-GGGGG GGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGTTCCGTGGCACTAGGTCCAA-3’和MMP-9-rs3918255-A：5’-GGGGGGGGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGG GGGGG GGGGGGGG GGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGGTTCCG TGGCACTAGGTCCAA-3’。

1.3.3 Snapshot延伸反应 延伸反应体系：5.2 μL水，1.2 μL的5×测序buffer，1.6 μL的Snapshot mix，引物各加入1 μL，PCR产物加入2 μL。延伸条件:96℃1 min，（96℃10 s，52℃5 s，60℃30 s）×28，4℃∞。取延伸产物5 μL于1%琼脂糖凝胶上进行电泳。

1.4 统计学方法

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。计量资料以均值±标准差（±s）表示，两组间比较采用独立样本t检验。计数资料以频数或百分比表示，组间比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 对照组和卵巢癌组的一般临床资料比较

对照组和卵巢癌组的年龄、初潮年龄、初次生育年龄、末次生育年龄、体质量指数（BMI）、产次、流产史以及月经情况比较，差异均无统计学意义（P均>0.05），见表1。

表1对照组和卵巢癌组患者的一般临床资料比较

2.2 Snapshot分析基因型结果

MMP-7的rs138970782位点的PCR产物经过延伸引物延伸后能够形成两种不同的条带。GG纯合基因型有65 bp的一个条带，GA杂合基因型有65 bp和90 bp的两个条带，而AA纯合基因型只有90 bp的一个条带。MMP-9的rs3918255位点的PCR产物经过延伸引物延伸后也能够形成两种不同的条带。CC纯合基因型有63 bp的一个条带，CA杂合基因型有63 bp和92 bp的两个条带，而AA纯合基因型只有92 bp的一个条带，见图1。

图1 MMP-7的rs138970782位点及MMP-9的rs3918255位点延伸产物分析

2.3 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌风险的关系

卵巢癌组MMP-7的rs138970782位点AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位点AA基因型比例、A等位基因比例均高于对照组（P均<0.05），见表2。

表2 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌风险的关系［例（%）］

2.4 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌FIGO分期的关系

FIGO分期Ⅲ~Ⅳ期者MMP-7的rs138970782位点AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位点AA基因型比例、A等位基因比例均高于FIGO分期Ⅰ~Ⅱ期者（P均<0.05），见表3。

表3 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌FIGO分期的关系［例（%）］

2.5 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌分化程度的关系

低分化组MMP-7的rs138970782位点AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位点AA基因型比例、A等位基因比例均高于中分化组和高分化组（P均<0.05）；中分化组MMP-7的rs138970782位点AA基因型比例、A等位基因比例和MMP-9的rs3918255位点AA基因型比例、A等位基因比例均高于高分化组（P均<0.05），见表4。

表4 MMP-7及MMP-9的基因多态性与卵巢癌分化程度的关系［例（%）］

3 讨论

卵巢癌的发生发展过程涉及多种促癌基因和抑癌基因的表达异常[5-6]，有研究[7-8]报道，肿瘤转移是卵巢癌进展的主要危险因素，调节卵巢癌转移相关基因的多态性与卵巢癌的发生发展密切相关。MMP-7和MMP-9均属于MMP蛋白家族，具有蛋白酶活性，能够降解胞外基质蛋白而起到促进肿瘤细胞转移的作用[9-10]。

本研究发现对照组和卵巢癌组的年龄、初潮年龄、初次生育年龄、末次生育年龄、BMI、产次、流产史和月经情况相比差异无统计学意义，而卵巢癌组MMP-7的rs138970782位点A等位基因比例明显升高，表明卵巢癌的发生与年龄和初潮年龄等临床资料无关，而与MMP-7基因的多态性有关。分析原因可能为MMP-7是促癌基因，MMP-7包括前肽区和催化区两个结构区，其基因多态性能够上调MMP-7基因表达，MMP-7基因启动子多态性能够上调MMP-7表达，在胶原蛋白、弹性蛋白、纤连蛋白、蛋白聚糖及层粘连蛋白等各种细胞外基质中MMP-7具有广泛水解酶活性，MMP-7可以通过诱导明胶酶活化起到促进卵巢癌细胞在体内的侵袭和转移的作用[11]。同时，对膀胱癌的研究结果显示，MMP-7的基因多态性能够影响MMP-7基因转录，从而影响膀胱癌进展[12]。进一步研究显示，FIGO分期Ⅲ-Ⅳ和低分化卵巢癌患者MMP-7的rs138970782位点A等位基因比例升高，表明MMP-7的基因多态性与卵巢癌患者的恶性程度密切相关，并且G等位基因突变成A等位基因会促进卵巢癌的进展。分析原因可能为MMP-7基因表达与肿瘤的转移和分化密切相关，MMP-7基因多态性会引起MMP-7基因表达异常，MMP-7能够切割HSPG2蛋白复合物，因此MMP-7在基因位点变化影响下异常升高，从而增加卵巢癌的恶性程度；同时MMP-7基因多态性能够调节转录复合物结合MMP-7基因启动子达到调节MMP-7基因表达作用，进而影响癌症的发生和发展[13-14]。

本研究发现卵巢癌组年龄和初潮年龄等临床资料与对照组差异无统计学意义，而卵巢癌组MMP-9的rs3918255位点A等位基因比例升高，实验结果表明MMP-9的rs3918255位点从C等位基因突变成A等位基因会促进卵巢癌的发生。分析原因可能为MMP-9基因多态性会引起MMP-9表达异常，从而激活肿瘤增殖和转移相关信号通路，导致卵巢癌的发生，另外上调MMP-9表达能通过激活VEGF信号通路、ERK1/2信号通路促进细胞的侵袭和转移以及细胞增殖[15-16]。进一步研究发现，MMP-9的基因多态性与卵巢癌的FIGO分期和分化程度密切相关，并且rs3918255位点从C等位基因突变成A等位基因与患者FIGO分期增高以及分化程度下降联系密切，分析原因可能为MMP-9的rs3918255位点多态性会影响微小RNA对MMP-9的转录抑制作用，从而上调MMP-9表达并促进卵巢癌进展。

本研究不足之处是与研究的MMP-7基因、MMP-9基因的SNP位点完全相关的文献相对较少，结论性的文献支持较少，因此后续应针对其SNP位点的变化以及具体机制进行深入研究。

综上所述，MMP-7和MMP-9的基因多态性与卵巢癌易感性联系密切，MMP-7的rs138970782位点从G等位基因突变成A等位基因以及MMP-9的rs3918255位点从C等位基因突变成A等位基因均会导致卵巢癌FIGO分期增高以及分化程度下降。