维生素D干预对再次体外受精鲜胚移植结局的影响

宋国红，赵君利

（1.宁夏医科大学，银川 750004；2.宁夏中医医院暨中医研究院，银川 750021；3.宁夏医科大学总医院生殖医学中心，银川 750004）

维生素D（vitamin D）是人体必需的一种维生素，其活化代谢物为1，25-（OH）2D3，机体主要通过自身合成以及从食物中摄取获得。多年来，人们对维生素D的研究仅集中在对钙、磷、骨代谢的调节。Parikh等[1]研究发现，维生素D能提高芳香化酶的活性，增加孕酮（progesterone，P）、雌激素、雌酮等在人类卵巢细胞中的产生，1，25-（OH）2D3可使人黄素化颗粒细胞产生更多的P，为胚胎着床提供更佳的子宫内膜环境。1，25-（OH）2D3还可参与子宫内膜基质细胞HOXA基因的表达[2]，影响子宫内膜的容受性及胚胎的种植[3]。维生素D受体（vitamin D receptor，VDR）广泛存在于人体的多种组织细胞中。有研究[4]发现，敲除VDR及1α-羟化酶后的小鼠模型，其子宫发育不良、卵泡生成障碍、卵巢血管因子表达水平下降。目前虽然对维生素D与体外受精（in vitro fertilization，IVF）-胚胎移植（embryo transplantation，ET）技术结局关系的研究较多，但结论差异较大。故本课题拟研究IVF鲜胚移植失败者血清25（OH）D水平与临床指标的相关性，探讨维生素D干预能否对再次IVF鲜胚移植结局产生影响，以期为临床诊治工作提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2016年12月至2019年1月就诊于宁夏医科大学总医院生殖医学中心前次长方案行IVF鲜胚移植失败后拟再次行IVF鲜胚移植的不孕患者。纳入标准：1）年龄20～42岁；2）不孕原因为输卵管因素、卵巢储备功能下降、排卵功能障碍、不明原因；3）男方因素不育。排除标准：1）有辅助生殖助孕技术禁忌证者；2）内分泌代谢性疾病者；3）生殖系统发育异常者。

1.2 分组

1）根据2011年《美国内分泌协会临床实践指南》及我国2014年《维生素D与成年人骨骼健康应用指南》，将维生素D的营养标准划分为维生素D适宜［血清25（OH）D＞30 ng·mL-1］、维生素D不足（A组）［20 ng·mL-1≤血清25（OH）D≤30 ng·mL-1］4例、维生素D缺乏（B组）［10 ng·mL-1≤血清25（OH）D＜20 ng·mL-1］35例、维生素D重度缺乏（C组）［血清25（OH）D＜10 ng·mL-1］12例，转换系数：2.5 nmol·L-1血清25（OH）D=1 ng·mL-1血清25（OH）D。2）我国体质量分组标准（中国肥胖问题工作组，2001）。根据体质量指数（body mass index，BMI）将所有研究对象分为消瘦（BMI＜18.5 kg·m-2）、正 常（18.5 kg·m-2≤BMI＜24 kg·m-2）、超重（24 kg·m-2≤BMI＜28 kg·m-）2及肥胖（≥28 kg·m-2）4组。3）根据研究对象的年龄将其分为高龄（≥35岁）组与非高龄（＜35岁）组。

1.3 方法

1.3.1 血清样本收集及测定 检测拟再次行IVF鲜胚移植的患者血清25（OH）D的水平。对血清25（OH）D＜30 ng·mL-1的患者均给予维生素D210 mg，2周/次，肌肉注射3次+碳酸钙D3片500 mg·d-1/次，口服治疗6周后再次进入IVF周期行鲜胚移植。检测移植日患者空腹血清雌二醇（estradiol，E2）及P水平。

1.3.2 治疗方案及获卵 所有患者均采用长方案，即于患者月经周期第19～22天给予皮下注射长效促性腺激素释放激素激动剂（达菲林，注射用醋酸曲普瑞林）0.935 mg，达到降调标准后，即给予外源性促性腺激素（gonadotropins，Gn）进行控制性超促排卵。根据患者血清E2、P、促黄体生成素（LH）水平及卵泡发育情况调整Gn剂量，当至少有一个卵泡直径＞18 mm或2个卵泡直径＞17 mm或3个卵泡直径＞16 mm时，当日晚9时皮下注射人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，HCG）2 000 U+注射用重组人绒促性素（艾泽，德国默克雪兰诺公司）250 μg，36 h后经阴道超声引导下穿刺采卵。统计患者Gn使用总天数及Gn总用量，记录取卵日的总获卵数。

1.3.3 ET卵母细胞培养4～6 h行常规IVF，在实验室观察，第2次减数分裂中期的成熟卵母细胞又称为MⅡ卵，其具备受精能力；精卵结合后，细胞核会分别形成1个原核，当有2个原核即为2PN，说明正常授精，记录MⅡ卵数及2PN数。胚胎受精48 h后进行形态学评分，若卵裂球细胞大小一致、数目为7～9个，无核碎片≤20%则为优质胚胎[5]。对于满足鲜胚移植条件的患者，选择1～2枚优质胚胎进行移植。于移植当日行阴道B超监测子宫内膜形态及厚度，对于子宫内膜的不同形态临床用A、B、C型表示。

1.3.4 妊娠确定ET后第14天测得血清HCG阳性确定妊娠，移植后28 d行阴道超声检测提示宫腔内可见妊娠囊则诊断为临床妊娠。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0统计学软件进行数据分析，计量资料首先进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用方差分析，两组间比较采用t检验，维生素D干预前后比较采用配对样本t检验，计数资料以百分率表示，组间比较采用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同BMI患者血清25（OH）D水平比较

结果显示，消瘦、正常、超重、肥胖组血清25（OH）D水平分别为（10.05±3.32）、（13.93±4.91）、（13.59±4.47）、（9.60±4.24）ng·mL-1，各组间比较差异无统计学意义（F=0.388，P=0.454）。

2.2 不同年龄患者血清25（OH）D水平比较

高龄组与非高龄组患者血清25（OH）D水平分别为（12.84±4.04）、（14.01±5.22）ng·mL-1，不同年龄组间比较，差异无统计学意义（P=0.402）。

2.3 不同血清25（OH）D水平患者临床指标比较

A、B、C三组患者的年龄、BMI、抗缪勒氏管激素（anti mullerian hormone，AMH）、促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）、三碘甲状腺原氨酸（triiodothyronine，T3）及甲状腺素（thyroxine，T4）差异均无统计学意义（P均＞0.05），见表1。

2.4 维生素D干预前、后IVF鲜胚移植相关指标比较

干预前后患者Gn天数、Gn用量、ET日子宫内膜形态及厚度、移植日血清E2、P水平及E2/P差异均无统计学意义（P均＞0.05），而获卵数、MⅡ卵数、2PN数在维生素D干预后均优于维生素D干预前（P均＜0.05），见表2。

表1不同血清25（OH）D水平患者临床指标比较（±s）

表1不同血清25（OH）D水平患者临床指标比较（±s）

组别A组B组C组F值P值n 4 3 5 12年龄/岁 AMH/（ng·mL-1）BMI/（kg·m-2）TSH/（mIU·L-1）T3/（nmol·L-1） T4/（nmol·L-1）31.50±5.97 1.63±0.63 20.90±1.69 1.79±0.41 1.63±1.00 5.94±3.45 32.80±4.71 2.89±2.41 22.26±3.26 2.83±1.56 1.27±0.56 7.06±2.51 32.42±4.32 2.68±2.00 22.30±3.62 2.65±1.48 1.57±0.87 6.63±3.38 0.150 0.572 0.562 1.119 1.235 0.346 0.861 0.568 0.574 0.336 0.300 0.709

2.5 不同血清25（OH）D水平患者维生素D干预后临床妊娠率及活产率比较

A、B、C三组患者临床妊娠率分别为25.00%、22.86%和41.67%，活产率分别为25.00%、14.29%和41.67%，差异均无统计学意义（χ2=1.601，P=0.449；χ2=3.991，P=0.136）。

表2维生素D干预前、后IVF鲜胚移植相关指标比较（±s）

表2维生素D干预前、后IVF鲜胚移植相关指标比较（±s）

相关因素 干预前 干预后 t值 P值Gn天数/d 10.45±3.10 11.25±3.41 1.469 0.148 Gn用量/U 2 009.10±690.03 2 262.49±863.18 1.976 0.054获卵数/个 6.67±3.84 8.41±4.80 3.534 0.001 MⅡ卵数/个 5.37±3.3 2.77±2.46 7.14±4.00 3.841 0.001 2PN数/个 6 4.26±3.33 3.070 0.003 ET日子宫内膜厚度/cm 12.86±2.35 12.56±2.52 1.017 0.310 ET日子宫内膜形态 2.14±0.45 2.24±0.47 1.218 0.229 ET日E2/（pg·mL-1） 894.29±854.90 1 080.79±981.94 1.421 0.161 ET日P/（ng·mL-1） 90.63±60.33 85.51±45.18 0.521 0.605 ET日E2/P 11.39±13.50 13.93±13.01 1.059 0.290

3 讨论

血清25（OH）D在整个月经周期中波动较小[6]，且易测量、结果较准确。故本次研究以接受IVF鲜胚移植患者月经周期任意一天的空腹血清25（OH）D水平为样本。因为血清25（OH）D为亲脂性分子，更易储存于人体脂肪组织。研究[7]表明，肥胖与体内维生素D水平相互影响，多囊卵巢综合征（PCOS）患者维生素D水平与BMI呈负性相关。Wehr等[8]采用多元回归分析研究也发现血清25（OH）D水平与BMI、腰围、腰臀比、血压、空腹和刺激后葡萄糖水平、葡萄糖曲线下面积、空腹胰岛素、胰岛素抵抗指数HOMA－IR等呈负相关。Parikh等[1]研究发现，成人BMI每增加1 kg·m-2，血清25（OH）D浓度就下降0.75 nmol·L-1。Stokic′等[9]对50例肥胖患者的研究同样也证实，高BMI个体较低BMI个体的血清25（OH）D水平降低。这不仅因肥胖者户外活动减少导致日照减少，也与其维生素D的生物合成效率明显下降有关。本研究中患者BMI范围为16.2~35.7 kg·m-2，根据BMI的水平将患者分为消瘦、正常、超重、肥胖组，各组间血清25（OH）D水平差异无统计学意义，可能是因为此次研究样本量有限，且进入IVF周期的患者临床医师会建议其进行饮食控制及体质量管理。

AMH基因仅表达于性腺，AMH由颗粒细胞分泌，在女性中的生理作用主要体现为参与卵泡形成过程中二次重要募集，即调控卵泡起始募集和参与调控卵泡生长发育至成熟卵泡的周期募集。研究[10-11]证明，AMH可以反映女性原始卵泡的库存情况，能较好地评估卵巢储备能力及预测卵巢低反应。Merhi等[12]研究表明，在卵巢颗粒细胞中，维生素D参与AMH信号通路，1，25-（OH）2D3可改变颗粒细胞对AMH的敏感性，促进颗粒细胞的分化与发育。本研究中患者的AMH与血清25（OH）D水平不存在相关性，这与有关研究[13]结果相同。有研究[14]表明，甲状腺功能与维生素D之间有复杂的相互作用，甲状腺激素能抑制25（OH）D 1α－羟化酶分泌。此外，维生素D能抑制TSH分泌，从而对甲状腺滤泡细胞产生直接效应。然而，有关维生素D与甲状腺功能的研究很少，结果也不尽相同，本研究发现鲜胚移植患者的T3、T4、TSH水平与其血清25（OH）D水平均无相关性。但因本生殖中心前次IVF鲜胚移植失败后再次行鲜胚移植的患者人数较少，血清25（OH）D水平对不孕患者各项临床指标的预测作用尚待后续研究补充。

卵子质量直接影响妊娠结局。研究[15]发现，维生素D可抑制AMH基因的表达，上调促卵泡刺激素受体基因表达，在卵泡发育成熟并成功排卵过程中发挥关键作用。VDR发生无效突变后，可导致卵巢功能过早衰退，直接影响卵子质量[16]。万彦伶等[17]也认为，维生素D可调节卵泡的募集，也可通过影响卵巢性激素的水平来干扰卵泡的成熟与排卵。这与本研究中给予维生素D干预后患者获卵数及优质胚胎数目提高的结论相符。也有研究[18]结论与之相反，认为VDR与卵子质量无关。子宫内膜容受性是指子宫内膜对胚胎的接受能力，只有在短暂的特定时期内，子宫内膜才允许胚胎着床，这一时期称为“着床窗口期”。Vitiello等[2]认为1，25-（OH）2D3参与子宫内膜基质细胞HOXA10/11基因的表达，从而影响子宫内膜的容受性及胚胎的种植。有研究[12]发现，维生素D可通过调节胎盘泌乳素、HCG的合成和分泌，营养子宫内膜，维持黄体功能。一项通过对供卵周期的研究[19]认为，维生素D可能并不影响卵子质量，而是通过影响子宫内膜从而影响妊娠率。内膜的树突状细胞及巨噬细胞可产生1α－羟化酶及1，25-（OH）2D3，而1，25-（OH）2D3能与子宫内膜上的VDR结合，调节靶基因，如钙结合蛋白、骨调素等，而这些靶基因与胚胎植入和胎盘形成有着重要关系。一项回顾性分析显示[20]，扳机日血清P和E2水平的平衡是提高子宫内膜容受性、维持妊娠的必要条件，P/E2可以较好地预测IVFET妊娠结局。本研究将维生素D干预前后患者子宫内膜形态及厚度、移植日血清E2、P及E2/P进行比较，差异均无统计学意义，表明维生素D水平可能不是通过影响子宫内膜及血清激素水平而影响妊娠结局，但仍需大样本进一步研究。

目前国内外对维生素D与IVF-ET结局关系的研究较多，但结论差异较大。有研究[19，21-22]认为，不孕症患者普遍存在维生素D缺乏，IVF-ET患者的妊娠率下降可能与维生素D缺乏有关。Polyzos等[21]研究结果显示，维生素D缺乏是导致低临床妊娠率的独立因素。一项对卵巢储备功能良好的IVF-ET女性的研究结果[23]也同样显示，维生素D缺乏是不孕症发生及影响IVF-ET结局的重要因素。Aleyasin等[15]在接受辅助生殖技术治疗的82例不孕妇女中发现，血清和卵泡液中的25（OH）D水平和IVF结局无明显的相关性。Irani等[24]Meta分析结果显示，维生素D水平并不能预测IVF-ET结局。这与本研究中维生素D干预对IVF鲜胚移植者的妊娠率及活产率无明显影响的结论一致。也有研究[18]结果显示，过高的维生素D水平能够使胚胎质量下降，可降低IVF-ET患者的临床妊娠率。

综上所述，IVF鲜胚移植失败患者的血清维生素D水平与其年龄、BMI、AMH及甲状腺体功能无相关性。维生素D干预治疗可以改善不孕患者的卵巢功能及卵子质量，对IVF鲜胚移植患者的妊娠结局无明显影响。由于本研究样本量的局限性，对维生素D参与调节鲜胚移植及对人类生殖系统功能的作用机制还需要进一步深入研究。