丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对脑胶质瘤U251细胞增殖和迁移能力的影响

石国荣，魏秀琴，王雪芳，王志旭，张海清

（1.武威市人民医院麻醉科，武威 733300；2.武威市人民医院肝病科，武威 733300；3.武威市人民医院产科，武威 733300；4.武威市人民医院药剂科，武威 733300）

脑胶质瘤（gliomas）是大脑和脊髓胶质细胞癌变所产生的最常见的原发性颅脑恶性肿瘤。高级别胶质瘤（high-grade gliomas，HGG）是指根据世界卫生组织（WHO）所列的恶性程度，分类为Ⅲ～Ⅳ级的胶质瘤。HGG恶性程度较高，5年存活率较低，目前影响其进展的既定因素较多，包括患者年龄、肿瘤等级、基因突变、手术切除范围和放化疗等[1]。尽管在脑胶质瘤切除手术中麻醉药的暴露时间相对较短，但涉及的血流动力学变化和所用药物也可能影响脑胶质瘤患者的术后结局[2]。研究[3]表明，麻醉方式的选择会影响非脑癌的预后，此外，一些麻醉药物如丙泊酚、右美托咪定及硫喷妥钠等静脉麻醉药物可能通过某种途径影响肿瘤细胞的恶性表型，被考虑是潜在的抑癌药物，但其在脑胶质瘤中的效应仍有待揭示。研究[4]显示，C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2是影响肿瘤细胞恶性行为的重要原癌基因，影响脑胶质瘤的发生与发展。本研究就脑胶质瘤手术常用的静脉麻醉药物对HGG细胞恶性表型的影响及与相关原癌基因表达的关系进行了探究。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1）细胞：人HGG细胞U251（上海生命科学研究院）。2）试剂：RPMI-1640、胎牛血清由美国Gibco公司提供，丙泊酚注射液（200 mg/支，批号：1910031，西安力邦制药有限公司），右美托咪定注射剂（0.2 mg/支，批号：190926，四川国瑞药业有限公司），注射用硫喷妥钠（1 g/支，批号：190714，上海新亚药业有限公司），CCK-8试剂由日本同仁化学研究所提供，Matrigel基质胶及转移小室（Transwell chamber）由美国Corning公司提供，RNAiso Plus、逆转录试剂盒及核酸荧光染料SYBR Green（日本Takara公司），RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），GAPDH、C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2抗体及相应二抗（美国Proteintech公司），ECL化学发光超敏显色试剂盒（上海翌圣生物科技有限公司）。3）仪器：7500型实时荧光定量PCR仪（美国Ap－plied Biosystems公司），T100 PCR仪及Gel Doc XR+型凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司），NanoDrop 2000超微量分光光度计（美国Thermo Fisher Scientific公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞培养及分组U251细胞采用90%RPMI-1640+10%FBS，于37℃、95%相对湿度、5%CO2恒温细胞培养箱中培养。培养对数生长期的U251细胞，1∶2传代，接种至10 cm培养皿中并分为对照组、丙泊酚组、右美托咪定组（右美组）及硫喷妥钠组（硫喷组）。对照组用生理盐水处理6 h，丙泊酚组以4 mg·L-1丙泊酚处理6 h，右美组以50 nmol·L-1右美托咪定处理6 h，硫喷组以500 μmol·L-1硫喷妥钠处理6 h，更换常规培养基继续培养6 h，处理条件参照文献中用量[5-7]。

1.2.2 CCK-8实验检测各组U251细胞增殖能力 将各组细胞以1×103/孔接种至96孔细胞培养板中，总体积100 μL，每组实验设置5个平行孔，待细胞贴壁后，每孔分别加入10 μL的CCK-8试剂，培养箱中孵育2～4 h，使用酶联仪检测细胞的OD450值，相同的方法检测细胞培养24、48、72 h后的OD450值，以细胞OD24/48/72h/OD0h表示细胞相对增殖能力。

1.2.3 克隆形成实验检测各组U251细胞克隆形成能力 将细胞以1×103/孔接种至6孔细胞培养板中，2 mL 90% RPMI-1640+10% FBS培养，每3 d更换培养基，2周后使用无水乙醇固定10 min，0.1%结晶紫染色30 min，每组重复3个孔，拍照并采用Image J软件计数。

1.2.4 Transwell实验检测各组U251细胞的侵袭及迁移能力 无血清RPMI-1640培养基稀释Matrigel基质胶至50 mg·L-1，均匀铺至Transwell小室上室面，37℃风干4 h备用，另取等量未铺胶的小室备用，1% FBS＋RPMI-1640重悬各组细胞，将细胞数调整至5×105个/mL，200 μL细胞悬液接种至Transwell小室上室面，下室面加入10%FBS＋RPMI-1640共600 μL，铺胶的小室作为细胞侵袭模型，未铺胶的小室作为细胞迁移模型，37℃、95%相对湿度、5% CO2恒温细胞培养箱中培养24 h，拭去上室面未穿透细胞，无水乙醇固定10 min，0.1%结晶紫染色30 min，200倍光镜下计数，随机从中间和4周选取5个视野计数细胞，计算平均值及标准差。

1.2.5 PCR检测各组U251细胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2的mRNA表达 采用RNAiso Plus试剂抽提细胞总RNA，检测RNA浓度，取1 μg RNA进行逆转录反应，得到cDNA后稀释至500 μL，合成引物稀释至0.2 μmol·L-1，设置3个平行孔，进行qPCR反应。预变性：50℃2 min，94℃10 min；扩增阶段：94℃15 s，60℃1 min；熔解阶段：94℃15 s，60℃1 min，94℃30 s，60℃15 s，以GAPDH为内参基因，2-△△CT法计算C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2的mRNA的相对表达水平，相关引物序列见表1。

表1各待测基因引物序列

1.2.6 Western blot实验检测各组U251细胞CMYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白的表达 采用RIPA蛋白裂解液抽提细胞总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度，取30 μg蛋白进行10%聚丙烯酰胺凝胶电泳，稳压120 V，湿法转PVDF膜，稳流260 mA，10%脱脂牛奶室温封闭1 h，1∶1 000 C-MYC、PDGFR、EGFR、MDM2及内参GAPDH一抗4℃孵育条带过夜，1∶3 000二抗室温孵育1 h，ECL发光液孵育条带，化学发光仪进行曝光显影并扫描条带灰度，利用Image J软件计算条带灰度，用目的基因灰度与内参基因GAPDH灰度比值衡量目的基因表达量。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0统计学软件进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组均数比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），进一步两两比较采用SNK-q检验。检验水准α=0.05（双侧）。

2 结果

2.1 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞增殖能力的影响

CCK-8结果显示，丙泊酚组、右美组及硫喷组U251细胞相对增殖能力在48 h及72 h时均低于对照组（P均＜0.05）；克隆形成实验显示，对照组、丙泊酚组、右美组及硫喷组克隆形成数分别为（152.2±14.55）、（86.01±8.679）、（102.50±5.015）及（107.6±5.329）个，各麻醉药物组的克隆形成数均低于对照组（P均＜0.01），见图1。

图1 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞增殖能力的影响

2.2 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞侵袭及迁移能力的影响

对照组、丙泊酚组、右美组及硫喷组侵袭细胞数分别为（53.33±3.21）、（27.02±4.58）、（33.41±3.07）及（35.67±4.16）个，迁移细胞数分别为（133.00±9.84）、（79.67±8.02）、（92.90±6.15）及（108.17±6.57）个，各麻醉药组的侵袭及迁移细胞数均低于对照组；丙泊酚组侵袭及迁移细胞数均低于硫喷组（P均＜0.05），右美组仅侵袭细胞数低于硫喷组（P＜0.05），见图2。

图2 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞侵袭及迁移能力的影响

2.3 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2 mRNA表达的影响

与对照组相比，丙泊酚组C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2的mRNA表达均降低（P均＜0.01），右美组C-MYC及EGFR mRNA表达均降低（P均＜0.01），硫喷组PDGFR及EGFR mRNA表达均降低（P均＜0.01），见图3。

图3 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2 mRNA表达的影响

2.4 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白表达的影响

与对照组相比，丙泊酚组C-MYC、PDGFR、EGFR和MDM2的蛋白表达均降低（P＜0.05或P＜0.01），右美组C-MYC及EGFR蛋白表达均降低（P＜0.05或P＜0.01），硫喷组PDGFR和EGFR蛋白表达均降低（P均＜0.01），见图4。

图4 丙泊酚、右美托咪定和硫喷妥钠对U251细胞C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2蛋白表达的影响

3 讨论

手术切除是治疗HGG的主要手段，而其中静脉麻醉是不可或缺的环节。近年来，多种麻醉药物被发现影响恶性肿瘤的发生与发展：其一，丙泊酚作为烷基酸类的短效静脉麻醉药，与肿瘤细胞增殖抑制及凋亡诱导有关[8]，并通过多种途径影响肿瘤细胞放化疗敏感性[9]，其可通过调节多种微小RNA（microRNA）如microRNA-195、microRNA-1284、microRNA-24及EGFR通路、免疫抑制分子PD-L1等，抑制胃癌、肺癌、乳腺癌及宫颈癌等肿瘤的进展[10-14]。此外有研究[15-17]表明，丙泊酚也被发现在脑胶质瘤中发挥抑癌作用，其可抑制Wnt及NF-κB信号通路，上调抑癌基因microRNA-218，降低HGG细胞增殖、转移能力，并促进细胞凋亡。其二，右美托咪定是选择性α2-肾上腺素受体激动剂，因其强大的镇静和镇痛作用在肿瘤切除手术中广泛应用，有研究[18-19]显示，50 nmol·L-1剂量下的右美托咪定可显著抑制细胞的侵袭，但激活了细胞ERK1/2及PI3K通路，促进细胞对顺铂的抵抗能力并通过激动α2-肾上腺素受体信号传导促进肺癌和神经胶质瘤细胞的癌细胞存活。其三，硫喷妥钠作为临床麻醉药物同样参与影响HGG细胞恶性表型，Hurmath等[7]研究显示，2.5%的七氟醚及不同浓度的硫喷妥钠均对HGG细胞U87MG的迁移能力及基质金属蛋白酶-2存在抑制作用，有研究[20]认为硫喷妥钠还可通过抑制NF-κB信号通路，降低颅内炎性水平。

为了揭示上述静脉麻醉剂对脑胶质瘤细胞生物学行为的影响及可能的机制，本研究挑选了与肿瘤细胞恶性行为相关的多种核心调控分子作为研究对象，包括C-MYC、PDGFR、EGFR及MDM2。结果显示，丙泊酚、右美托咪定及硫喷妥钠均可抑制HGG细胞恶性增殖、侵袭及迁移能力，且丙泊酚效应最强。C-MYC是促进肿瘤细胞增殖、抗凋亡过程的关键因子，包括脑胶质瘤[21]；PDGFR及EGFR是重要的酪氨酸激酶受体，其在肿瘤中常被异常激活，促进下游多条原癌信号通路的活化，介导肿瘤细胞的恶性行为[22-23]；MDM2可引起抑癌基因TP53的泛素化降解，导致肿瘤的进展[24]。本研究结果发现，丙泊酚、右美托咪定及硫喷妥钠可不同程度地抑制上述原癌基因的表达，且丙泊酚对C-MYC及MDM2表达的抑制能力较强，相应地对HGG细胞恶性增殖及转移的抑制作用较强。综上所述，本研究表明，丙泊酚、右美托咪定及硫喷妥钠均能抑制HGG细胞体外增殖及转移能力，且丙泊酚抑制作用优于右美托咪定及硫喷妥钠。后期将进一步通过实验动物模型明确三种静脉麻醉药物体内的抑癌作用，为脑胶质瘤手术麻醉方案的优化提供研究基础。