烧伤后制动致创面愈合延迟的机制研究

徐子寒，朱秀梅，王本峰，高文杰，雷 诺，韩 峰

（1.陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科，西安 710000；2.西北工业大学医学研究院，西安 710072；3.西安市干细胞与再生医学重点实验室，西安 710072）

烧伤作为严重危害患者身体健康的疾病，是人们生产生活、灾害事故中极为常见的外伤，目前针对深度烧伤主要采用积极补液抗休克、早期切（削）痂去除坏死组织、同期或二期行自体皮移植方案等方法，而创面受皮区移植皮片存活状况是手术成功和患者预后的关键[1]。烧伤不但导致患者产生严重的生理性创伤，诸如剧烈疼痛、容貌损毁、躯体功能障碍以及皮肤汗腺受损而致排汗困难等，而且使烧伤患者出现心理障碍，如紧张感、恐惧感、孤独感以及自卑感，从而产生焦虑以及抑郁症状[2]。我国普通人群抑郁症的发病率为3%～5%，而烧伤患者焦虑、抑郁的发病率可高达55%[3]。

创面修复的内在病理生理机制和调控网络复杂，理解创面修复的机制与愈合转归的关系，有助于更好地进行创面修复临床实践[4]。传统观点认为，烧伤患者，尤其是大面积烧伤患者需长期制动以防移植皮片脱落，但长期制动可能对患者的心理健康造成不良影响，进而间接影响创面愈合。目前制动是否延缓创面愈合的作用及相关机制仍不清楚。本研究通过评估抑郁患者与烧伤面积及创面愈合率的关系，进一步构建烧伤后制动的小鼠模型，评估制动与创面愈合的关系，同时检测相关炎性因子和抑郁相关指标分析潜在的作用机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料及烧伤患者的抑郁评估

选取2018年1月至2021年6月就诊于陕西省人民医院烧伤整形医学美容外科的106例烧伤患者为研究对象。纳入标准：临床诊断创面为深Ⅱ～Ⅲ度烧伤，均需行创面自体皮移植术。排除标准：Ⅰ～浅Ⅱ度烧伤，或深Ⅱ～Ⅲ度烧伤但拒绝行植皮手术治疗的患者。

根据汉密尔顿抑郁量表（HAMD）24项评分，将烧伤患者分为重度抑郁（HAMD评分≥35分）、中度抑郁（20分≤HAMD评分＜35分）、轻度抑郁（8分≤HAMD评分＜20分）、无抑郁（HAMD评分＜8分）。根据病情进行常规自体皮移植术，患者植皮术后第3、7、10、14天分别测量合并抑郁与无抑郁组烧伤患者的创面植皮区愈合面积，计算第14天创面愈合率（愈合率=愈合面积/植皮面积×100%）。所有患者均签订知情同意书，该研究经过陕西省人民医院伦理委员会审批通过（202001047）。

1.2 实验动物及分组

健康雄性BALB/c小鼠24只，平均体质量（20.45±1.36）g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，术前7 d运达西北工业大学医学研究院SPF动物房，人工照明，明暗各12 h，室温24~26℃，湿度40%~70%，常规饮食。构建小鼠烧伤模型后随机分为4组：制动组、活动组、活动+镇痛组和制动+镇痛组。模型构建及小鼠饲养于西北工业大学医学研究院SPF动物房，实验动物伦理经过西北工业大学医学研究院伦理委员会审批通过（202002014）。

1.3 裸鼠烧伤并制动模型的构建和烧伤创面及体质量监测

采用YLS-5Q台式超级控温烫伤仪（湖南益延科技发展有限公司）于小鼠中下背部灼烧15 s，接触质量300 g，制动组小鼠于烧伤后放入特制的50 mL离心管中限制活动，离心管前后均开孔透气，制动组模型小鼠头部可自由转动并可正常进食水，每日制动6～8 h；活动组小鼠待烧伤模型构建完毕后即可自由活动和进食水。镇痛组小鼠采用局部涂抹利多卡因凝胶（购于华润紫竹药业有限公司）。于烧伤模型构建成功后的第3、8、15、19天测量小鼠烧伤创面的剩余面积，隔日监测小鼠体质量变化。

1.4 烧伤后制动裸鼠模型的抑郁评估

模型构建完毕，分别于烧伤模型构建成功后第19天将制动组、活动组、活动+镇痛组、制动+镇痛组小鼠倒挂，并将其尾部固定于水平杆上，小鼠头部与地面保持10 cm的距离，记录每只小鼠在6 min中的后4 min里悬尾静止的次数和悬尾静止时间（s）。

1.5 ELISA检测肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、IL-8，抗抑郁指标脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor，BDNF）及营养指标血清白蛋白（serum albumin，ALB）表达

人植皮术后第7天和小鼠术后第19天获取外周血血清，采用双抗体夹心法ELISA试验检测血清相关炎性因子的表达。TNF-α（人F0121-A；小鼠F2132-B）、IL-6（人F0049-A；小鼠F2163-B）、IL-8（人F1551-A；小鼠F2123-B）、BDNF（人F10420-A；小鼠F2204-B）均购于上海凡科维商城。预包被抗体的ELISA 96孔板微孔中依次加入血清标本、标准品HRP标记的检测抗体，温育60 min并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色，颜色的深浅和样品中相关炎性因子的表达呈正相关。酶标仪在波长450 nm下测定OD值，计算样品浓度。

1.6 统计学方法

采用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，计量资料经正态分布和方差齐性检验，以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用t检验；两因素的重复测量数据采用重复测量的方差分析；两组连续正态分布的线性数据采用Pearson相关性分析，两组连续非正态分布的数据采用Spearman相关性分析。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 烧伤患者HAMD评分与烧伤面积、植皮术后创面愈合率的关系

106例烧伤患者术前采用HAMD评分（24项），将烧伤患者分为重度抑郁组（61例）、中度抑郁组（23例）、轻度抑郁组（17例）和无抑郁组（5例）。Pearson相关性分析提示HAMD评分与烧伤面积呈正相关（r=0.590，P＜0.001），Spearman相关性分析提示HAMD评分与烧伤后植皮创面愈合率呈负相关（r=-0.634，P＜0.001），见图1。

图1 HAMD评分与烧伤面积和植皮术后创面愈合率的关系

2.2 抑郁患者外周血炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8和抗抑郁相关因子BDNF的表达水平

根据HAMD评分，重度抑郁患者的表型最明确，故将HAMD 35分作为本研究的截断值，将106例烧伤患者分为两组：HAMD≥35分（61例）、HADM＜35分（45例）。经比较，HAMD≥35分的烧伤患者TNF-α［（320 40±7 277）ng·L-1］、IL-6［（19 553±3 705）ng·L-1］和IL-8［（16 907±2 993）ng·L-1］分别均高于HAMD＜35分组患者［（15 986±7 001）ng·L-1、（13 511±3 048）ng·L-1、（10 137±3 461）ng·L-1］，而HAMD≥35分组的BDNF［（17 428±7 947）ng·L-1］低于HAMD＜35分组患者［（35 063±14 191）ng·L-1］（P均<0.01），见图2。

图2 抑郁患者HAMD评分与外周血中TNF-α、IL-6、IL-8和BDNF的表达变化

2.3 各组小鼠悬尾静止次数和悬尾静止时间比较

制动组小鼠较活动组的悬尾静止次数［（12.83±2.32）次vs（.6.01±2.89）次］增加，悬尾静止时间［（95.33±26.46）s vs（.3.67±17.87）s］亦延长（P均＜0.01）；制动+镇痛组小鼠较活动+镇痛组的悬尾静止次数［（11.33±2.25）次vs（.7.67±2.16）次］增加，悬尾静止时间［（86.83±19.90）s vs（.49.83±6.08）s］亦延长（P均＜0.01），见图3。

图3 烧伤后联合制动或局部镇痛小鼠的悬尾静止次数和悬尾静止时间

2.4 制动对小鼠背部大面积烧伤创面愈合的影响

自背部大面积烧伤模型构建成功后，连续观察19 d，并于第3天、8天、15天和第19天测量制动组、活动组、活动+镇痛组和制动+镇痛组小鼠的创面剩余面积，活动组小鼠的创面剩余面积少于制动组（F=6.417，P=0.000 3），活动+镇痛组小鼠的创面剩余面积较制动+镇痛组亦减少（F=4.505，P=0.003 5）。在观察终点第19天，活动组小鼠的创面剩余面积［（86.62±25.88）mm2］小于制动组（190.70±51.49）mm2］（P=0.001 3），活动+镇痛组小鼠创面剩余面积［（151.80±36.86）mm2］较制动+镇痛组（236.67±49.46）mm2］（P=0.007 2）减小，见图4。

进一步排除疼痛对创面愈合的影响，采用局部涂抹利多卡因凝胶的局部镇痛方式会延缓创面愈合速度，重复测量的方差分析结果提示，活动组小鼠的创面剩余面积较活动+镇痛组减小（F=3.421，P=0.015），制动组小鼠的烧伤创面剩余面积则较制动+镇痛组有改变（F=1.141，P=0.348 1），见图4。

图4 烧伤后制动或联合局部镇痛的小鼠烧伤创面愈合能力的差异

2.5 烧伤后制动的小鼠外周血炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8，抑郁相关指标BDNF和营养相关指标ALB的表达水平比较

在实验观察终点（第19天）于眼球取血并离心获取血清，ELISA检测发现烧伤后制动组小鼠的血清BDNF较活动组［（4.08±0.86）ng·L-1vs.（6.33±1.22）ng·L-1］降低（P＜0.05）；制动+镇痛组小鼠血清BDNF较活动+镇痛组［（3.92±0.74）ng·L-1vs.（5.57±1.13）ng·L-1］降低（P＜0.05）；制动组的IL-6［（171.1±32.71）ng·L-1vs（.65.75±16.09）ng·L-1］、IL-8［（10.79±2.41）ng·L-1vs（.6.07±1.89）ng·L-1，C］和TNF-α［（185.1±31.23）ng·L-1vs.（96.3±49.31）ng·L-1］均高于活动组，而制动+镇痛组小鼠血清的IL-6［（254.3±72.39）ng·L-1vs（.121.7±40.61）ng·L-1］、IL-8［（19.15±4.51）ng·L-1vs.（10.76±1.67）ng·L-1］和TNF-α［（323.7±72.51）ng·L-1vs（.199.7±62.06）ng·L-1］均高于活动+镇痛组（P均＜0.05），见图5。

为排除制动影响小鼠进饮食导致营养不良所致的创面愈合不良，隔日检测小鼠体质量发现，制动组、活动组、活动+镇痛组和制动+镇痛组小鼠体质量差异无统计学意义（F=0.923 7，P=0.577 8），在实验观察终点同样证实制动组与活动组、制动+镇痛组与活动+镇痛组的ALB表达差异均无统计学意义（P均>0.05），见图5。

图5 烧伤小鼠血清中炎性因子、抗抑郁因子及营养相关指标的表达变化

3 讨论

组织和细胞学研究提示，创面修复是机体自主调控、高度程序化、调控网络复杂、多因素参与的渐进过程。外科技术不断发展迭代，对创面愈合亦存在多重评价标准，包括直接评估创面的愈合率、组织病理学检测增殖和凋亡指标及相关信号通路、检测血清学炎性指标（TNF-α、IL-1、IL-6、IL-8）和相关生长因子（成纤维细胞生长因子FGF、表皮生长因子EGF、转化生长因子TGF-α等）的表达[4-8]。目前尚缺乏从患者整体角度评估和干预烧伤创面愈合的相关研究报道。

抑郁症是以心境和情绪低落、思维和意志活动减退为主要特征的全身性疾患，其发病因素和相关机制多样，一般认为与生物化学、遗传及社会环境因素密切相关。烧伤作为一种严重危害患者身体健康、容貌及肢体功能的疾病，会经历特殊的应激反应和心理反应。有研究[9]报道，在烧伤早期，患者有39.7%的抑郁发生率，而在烧伤康复期抑郁的发生率可高达58.3%。抑郁情绪是一种负性情绪，会延长创面愈合时间。临床常针对抑郁症患者给予口服药物、心理疏导、调换生活环境等改善抑郁的策略，但疗效均有限[10]。烧伤引发的抑郁与多种机制有关，包括单胺类神经递质学说、炎性细胞因子、肠道菌群失调等多种机制。目前认为：炎性反应因子的升高会引起炎性因子瀑布效应，致使肠道细菌失调和肠道毒素吸收，会加重原发疾病的恶化[11]。本研究入组106例烧伤患者，采用HAMD评估抑郁程度并分析其与烧伤创面大小及愈合速率的相关性，结果证实患者的抑郁程度与烧伤面积呈正相关，与创面愈合率呈负相关。本研究入组患者在治疗过程中，伴随体液大量渗出、进食受限等多种因素，反复合并低蛋白血症，体质量较入院时会有2～20 kg的下降。为排除营养状况可能对患者创面愈合的影响，本研究针对性采用持续肠内+肠外营养补充和间断补充人血白蛋白对症处理，因此可排除营养不良对创面愈合的干扰。在重度抑郁患者（HADM评分≥35分）血清中检测发现，炎性相关因子TNF-α、IL-6和IL-8表达升高。有报道[12]证实，随着烧伤创面的反复多次治疗，患者的焦虑抑郁评分持续升高，而烧伤创面治疗的效果逐渐降低。上述结果提示抑郁症状诱发的系统性炎症可能是延缓创面愈合的主要因素之一。

近年来，康复运动在改善抑郁症状中的重要性及必要性日益受到关注，躯体运动是改善心理状态的良好手段，适度的锻炼对抑郁症状具有显著的改善作用[13]。躯体运动与抑郁的关系研究主要源于普通人群，而烧伤患者长期卧床制动是否会诱发抑郁并影响创面愈合目前尚不明确[14]。本研究构建烧伤后制动小鼠模型，发现制动小鼠悬尾次数增加且悬尾时间延长，提示制动与小鼠烧伤后抑郁相关。同时，各组之间小鼠的体质量及外周血ALB的表达差异无统计学意义，排除小鼠营养不良对烧伤创面愈合的影响。持续观察还证实，制动组小鼠创面愈合速率较活动组延迟，残余烧伤面积较大。而联合局部采用利多卡因凝胶镇痛的小鼠，制动组的愈合速率亦降低。本实验结果可以证实，烧伤后制动可能是诱发抑郁的因素之一，进而影响烧伤植皮创面的愈合，而通过积极的适度运动可能对改善抑郁、提高创面植皮存活率、促进烧伤良性转归具有重要意义。

机体炎性反应与疾病严重程度和焦虑抑郁情绪存在相关性，烧伤后患者的交感神经兴奋，儿茶酚胺升高、糖皮质激素分泌和血清炎性因子均改变，这种相互影响可能是抑郁症状持久存在甚至持续加重的原因。BDNF可通过多种途径调控神经细胞的发生、生存、生长、分化和凋亡，并直接参与了神经突触的可塑性和重构，提示BDNF可作为抑郁的检测指标[15]。随着医学模式由生物模式向生物-心理-社会医学模式的转变[16]。本实验发现重度抑郁患者和制动后抑郁小鼠的血清中的抗抑郁相关指标BDNF表达均降低，进一步探索发现炎性相关因子TNF-α、IL-6和IL-8表达升高。为排除疼痛可能对创面愈合的间接影响，本研究联合局部采用利多卡因凝胶镇痛，发现创面较未使用组愈合延迟，同时伴随有部分炎性因子的表达升高，推测可能局麻药利多卡因凝胶对局部血管生成有影响或直接对创面有刺激作用，进而影响创面的愈合。本研究结果证实，抑郁症状与制动相关，而适度运动可能改善烧伤创面愈合速率，相关机制与降低血清炎性因子TNF-α、IL-6、IL-8表达和上调抗抑郁分子BDNF的水平有关。

综上所述，烧伤患者抑郁情绪会延缓创面愈合时间，烧伤后制动是引发抑郁的原因之一，可能通过引起多种血清中炎性相关因子改变，导致组织器官炎症-免疫微环境失衡，最终影响植皮创面愈合及患者病情转归，而术后完全制动可能加剧烧伤患者抑郁发生，不利于患者植皮创面的愈合，对术后的康复治疗亦有严重影响。