热活化延迟荧光纳米探针制备及其时间分辨成像研究

李海洋，傅妮娜（通讯作者）

（南京邮电大学材料科学与工程学院 江苏 南京 210023）

0 引言

荧光成像（FI）在生物医学研究和临床诊断方面表现出诸多优秀特质，例如：非侵入性、时空分辨率高、成像速度快、灵敏度高、费用低廉、无电离辐射等；可实现对生物体内肿瘤的发生、转移、肿瘤血管生成及抗肿瘤药物治疗等进行实时的特异性跟踪和探测，从分子、细胞水平上研究肿瘤内发生的一系列生理、病理学变化[1-2]。光学影像和传感技术的核心是荧光探针。

近年来，具有热致延迟荧光（TADF）性质的荧光发光体逐渐被用于荧光和时间分辨双模成像[3]。全有机TADF材料表现出优异的荧光发射（光吸收强、发光效率高、光稳定性好）[4-6]和生物相容性。宋锋玲等[3]研究小组最先开展基于热致延迟荧光分子的时间分辨成像（FLIM），例如，将全有机TADF小分子CPy制备成水溶性纳米颗粒后应用到生物成像中的独特性，该纳米颗粒既实现时间分辨荧光成像应用，又兼具无官能化细胞膜标记特性。本文设计合成的带叔丁基的TADF分子（tBu-CPy），以高密度的叔丁基提高其激发态寿命，通过纳米再沉淀的方法制备由两亲性聚合物DSPE-PEG2000包覆的水溶性的纳米颗粒（tBu-CPy NPs），见图1。tBu-CPy NPs具有荧光量子产量高和荧光寿命长的优势，能有效实现对Hela细胞膜的长效标记，实现激光共聚焦荧光显微成像和荧光寿命成像，以双模成像的方式有效避免细胞自发光对影像信号的干扰。

1 实验部分

1.1 药品与表征测试方法

本文中使用的3，6-二叔丁基咔唑，四氟氰基吡啶购自宁波卢米蓝新材料有限公司，碳酸钾、二甲亚砜（DMSO）等化学试剂均为纯度98%以上商业化原料。表征测试仪器包括：核磁共振波谱仪（JNM-ECZ400S/L1，JOEL），MALDI-TOF 质谱仪（Autoflex Speed，Bruker），紫外可见风光光度计（UV-1750,Shimadzu），荧光光谱仪（F4600, HITACHI），荧光显微镜（Olympas D-70，Park）等。核磁共振波谱：1H NMR使用 JNM-ECZ400S/L1型核磁共振波谱仪测试。以四甲基硅烷（TMS，δ=0 ppm）作为内标物质，根据样品特性选择氘代氯仿（CHCl3-d）进行测试。基质辅助激光解析飞行时间质谱（MALDI-TOF-MS）：使用1，8，9-三羟基蒽为电离基质，在 Bruker AutoflexⅡ型质谱仪上测试。

1.2 材料合成及表征

1.2.1 tBu-CPy合成

在干燥的两口瓶（100 mL）中，加入2，3，5，6-四氟-4-氰基吡啶（352 mg，2 mmol）、3，6-二叔丁基咔唑（2.69 g，4.8 mmol）、无水碳酸钾（1.92 g，14 mmol），用真空泵抽真空、连通氮气置换3次。以注射器加入DMSO（25 mL），在氮气的保护下，油浴锅中加热到145 ℃，搅拌15～30 min，薄层色谱监控发现反应完成。降温后，在反应体系中加纯净水，大量黄绿色沉淀生成，过滤后，对滤饼干法上样，硅胶色谱柱分离得tBu-CPy固体粉末。柱层析产物以甲醇和乙酸乙酯重结晶得到纯产物是1.85 g，产率76.3%。1H NMR（400 MHz,CDCl3）δ=7.63(s,4H），7.58（s,4H），7.17（s,4H），7.06（d,4H），6.98（d,4H），6.92（d,4H），1.36（m,72H）ppm。13C NMR（101 MHz,CDCl3）δ=155.81，141.30，139.36，137.32，136.56，129.06,126.52，121.06，120.71，114.77，55.59，28.55，24.26 ppm.MALDI-TOF-MS（m/z）:Calculated for C86H96N6:1212.7696；Found:1213.7684[M]+。

1.2.2 tBu-CPy NPs 制备

称取tBu-CPy（1 mg）和DSPE-PEG2000（2 mg），在THF（2 mL）中充分混匀，快速加入到10 mL的超纯水溶液中，同时在超声仪器中超声6～8 min，得到澄清的溶液。向其中加入大小合适的磁子，氮气球保护下在磁力搅拌器上室温下搅拌24 h。24 h后停止搅拌，以0.22 μm的水相过滤头过滤，得到DSPE-PEG2000包覆的tBu-CPy纳米颗粒澄清水溶液。该tBu-CPy纳米颗粒水溶液的浓度约为8.3×10-5M，标记为tBu-CPy NPs。

1.2.3 tBu-CPy纳米颗粒共聚焦成像

将冻干的tBu-CPy NPs溶解在DMEM培养基中（8 μM）与Hela 细胞共孵育。利用激光共聚焦荧光成像，研究该纳米颗粒对肿瘤细胞的荧光标记行为；同时，利用共聚焦荧光寿命成像显微镜（FLIM）来探究tBu-CPy NPs在癌细胞中时间分辨成像能力。

2 结果与讨论

2.1 tBu-CPy及tBu-CPy NPs的光物理性质

等浓度情况下所测试tBu-CPy（THF溶液）和tBu-CPy NPs（水溶液）的紫外-可见吸收光谱和荧光发射光谱，结果见图2。tBu-CPy和tBu-CPy NPs在各自溶液中的最强吸收峰均在280～370 nm，这属于tBu-CPy分子共轭骨架结构中的π-π*的跃迁；在450～470 nm之间的宽吸收峰是其分子内电荷转移态跃迁对应的吸收信号。tBu-CPy和tBu-CPy NPs具有非常相似的光吸收特性，仅后者较前者略微红移，表明大量叔丁基存在并未能完全抑制分子直接的堆积和π-π相互作用。tBu-CPy和tBu-CPy NPs的荧光最大发射峰分别出现在532 nm和547 nm处，后者相对前者略红移15 nm。可以看出将CPy制备成纳米颗粒时，tBu-CPy分子在聚集时荧光并不会发生淬灭，基于tBu-CPy的纳米粒子在生物细胞成像具有很好的应用前景。tBu-CPy NPs荧光发射峰强略弱于tBu-CPy在THF的发射，但依然保持高发光效率，表明聚集并未严重淬灭tBu-CPy的荧光发射。tBu-CPy NPs具有的深绿色光发射（547 nm），可以有效避免细胞基质自身的蓝光的影响。此外，tBu-CPy NPs的斯托克位移也较大，可有效避免入射光对荧光信号的干扰[7]，这些特性有利于tBu-CPy NPs作为高效的共聚焦荧光成像纳米探针。

为验证tBu-CPy NPs在光辐照条件下的稳定性，对其进行持续光照，记录其荧光发光强度变化。tBu-CPy NPs在 2 W/cm2白光光源持续照射，其中tBu-CPy NPs的浓度为6.0×10-6M，每隔5 min测一次荧光光谱，每次白光照射10 min。如图3所示，tBu-CPy NPs在较强光照下的荧光稳定性较好，持续90 min较大功率白光照射，其荧光强度衰减率仅为其荧光强度的3.5%。这表明tBu-CPy NPs在较低功率的激光共聚焦显微镜下，进行细胞成像测试时，其光稳定性能够保持，所受光照的影响较小，有利于长时间跟踪的荧光成像。

对tBu-CPy纳米颗粒样品测试量子效率和荧光寿命时间，室温、氮气氛下测试的荧光衰减曲线见图4。对图4曲线进行拟合，可知tBu-CPy纳米颗粒荧光寿命在3.6 μs左右，此数值远高于细胞基质常见组分几到十几纳秒的短寿命，表明tBu-CPy NPs可以作为时间分辨成像探针，对细胞或生物组织进行荧光寿命成像。由插入的小图可知，tBu-CPy纳米颗粒在透射电子显微镜（TEM）图像呈球形，直径为50 nm左右，粒径分布较为均一。对tBu-CPy NPs水溶液反复冻干、溶解后，发现tBu-CPy NPs始终能够保持非常好的溶解性和粒径分布稳定性。此外，对tBu-CPy NPs进行储存稳定性测试，发现其能在4 ℃冰箱和氮气气氛下保持6个月以上，其荧光强度几乎不变，以上研究均表明tBu-CPy NPs具有非常高的光稳定性和储存稳定性。

2.2 tBu-Cpy NPs在癌细胞中荧光成像的探究

由于tBu-CPy NPs具有良好的光稳定性以及较好的分散性和荧光发光寿命长的特性，将其作为荧光成像纳米探针应用于肿瘤细胞的共聚焦显微成像。通过MTT实验，验证tBu-CPy NPs对细胞活性的测试实验，见图5。在37 ℃恒温培养箱中，将不同浓度的tBu-CPy NPs与Hela细胞孵育培养24 h，探究Hela细胞的活性，其成活率均为80%以上；同等测试条件下，tBu-CPy NPs染色的Hela细胞，在37 ℃恒温培养箱培养48 h后，其成活率均为70%以上。MTT实验结果表明tBu-CPy NPs在达到80 μmol浓度级别时仍具有极低的毒性和良好的生物相容性。

图6是浓度为8.3 μM的tBu-CPy NPs孵育Hela细胞2 h后，利用激光共聚焦显微镜激光器照射60 min后，激光共聚焦荧光显微镜所测的细胞成像结果。如图6(a)所示，用tBu-CPy NPs孵育Hela细胞后，细胞膜上的荧光发射强度均高于细胞质和细胞核内，表明tBu-CPy NPs具有典型的细胞膜靶向特性。造成这一结果的主要原因是tBu-CPy分子中大量叔丁基存在，有利于其脂溶性，当tBu-CPy NPs进入Hela细胞后，包裹的DSPE-PEG2000与tBu-CPy分子分散，引起部分tBu-CPy嵌入细胞磷脂双分子层膜中[7-8]。利用405 nm激光器对经tBu-CPy NPs孵育Hela细胞进行荧光寿命（FLIM）共聚焦成像，见图6(d)。细胞大部分膜上以及少部分细胞质内出现来自tBu-CPy NPs的长寿命（数百纳秒）信号。此外，荧光寿命成像结果进一步证明，tBu-CPy NPs主要对Hela细胞膜而非细胞质染色定位。这一结果也证明了tBu-CPy NPs可以被用来进行Hela细胞膜标记的时间分辨成像。

3 结语

本文通过无催化剂方法，“一步法”高产率合成全有机热活化延迟荧光分子tBu-Cpy，并制备高稳定性的黄绿光发射的长寿命纳米探针 tBu-CPy NPs。荧光共聚焦显微成像和时间分辨成像研究表明，tBu-CPy NPs不仅能在无特殊修饰情况下实现对Hela细胞膜靶向，同时能实现高效的荧光和时间分辨双模成像。这一研究对更大范围的高效热活化延迟荧光分子应用于生物成像提供基础参考。