阴阳双补方治疗骨转移癌痛作用机制的网络药理学研究*

杨梦霞 毛 昀 芦殿荣 朱世杰 周 磊

（1.北京中医药大学，北京 100029；2.中国中医科学院望京医院，北京 100102；3.湖南中医药大学第二附属医院，湖南 长沙 410005）

疼痛是骨转移癌患者常见并发症，发生率为40%～70%，给晚期肿瘤患者的生存质量带来了严重不良影响［1］。尽管现代医学上各种癌痛管理指南不断出现，但仍有50%的患者没有得到足够的疼痛缓解［2］，45%的晚期患者会经历中到重度的疼痛［3］，并且癌痛发生率在过去40年中并未降低［4］。近年来，中医药工作者在长期临床实践中发现，中医作为一种癌痛辅助治疗的方法，在临床上取得了一定疗效。

历代中医典籍中虽没有癌痛的明确记载，但根据其临床表现，多将其归于“痛证”范畴。《金匮要略·脏腑经络先后病脉证并治》中有“病人语声寂寂然喜惊呼者，骨节间病”，其描述与骨转移癌痛相似；此外亦有“骨节疼痛”“骨痛肉枯”等可与骨转移癌痛相联系。肾主骨生髓，故其病位在肾，肾精不充、骨髓失养、癌毒乘虚入骨胶结不去导致骨肿瘤形成是骨转移癌痛形成的前提，而后癌毒盘踞，可致筋骨经络失养或肌肉、骨骼等受压，进而发生疼痛。故在临床实践中，中医治疗多以扶正祛邪为主。本研究团队通过总结全国名老中医李佩文教授临床用药经验发现，归肾经方“阴阳双补方”不仅对骨转移有效，在癌痛治疗方面也有着较好的临床疗效，前者作用机制已在团队前期研究中阐明［5］，而后者作用机制尚未清楚。因此本研究拟从网络药理学角度对“阴阳双补方”治疗癌痛的作用机制进行初步探讨，以便为今后癌痛临床治疗提供更多参考依据。

1 材料与方法

1.1 阴阳双补方主要化合物筛选 在中药数据库TCMSP中，检索阴阳双补方所有化合物，保留OB≥30%且DL≥0.18的成分；当某些药物化合物在TCMSP中检索不到时，使用TCMID及TCM Database@Taiwan数据库进行补充。

1.2 阴阳双补方药物靶点预测 使用化合物信息数据库PubChem检索阴阳双补方主要化合物所对应的SMILES化学结构，并在Swiss Target Prediction数据库中根据化学结构相似性，保留相似度高的靶点；最后使用Cytoscape3.8.2中的cytoHubba插件，筛选出药物Hub靶点并进行可视化。

1.3 骨转移癌疾病基因筛选 使用GeneCards疾病数据库分别查询骨转移及癌痛基因，保留“Score≥15”的疾病基因。

1.4 阴阳双补方潜在治疗靶点预测 通过将“阴阳双补方”、骨转移及癌痛基因进行韦恩映射分析，筛选出潜在治疗靶点；使用STRING11.5数据库分析潜在治疗靶点功能关联情况并可视化。

1.5 “中药-化合物-潜在治疗靶点”网络图绘制 分别构建“中药-化合物-潜在治疗靶点”关系表和节点属性表，并将其导入Cytoscape3.8.2中，绘制多层次相互作用的“中药-化合物-潜在治疗靶点”网络图。

1.6 潜在治疗靶点功能分析 在DAVID数据库中对潜在治疗靶点进行GO富集分析及KEGG通路富集分析（FDR ＜ 0.05）。

2 结果

2.1 阴阳双补方主要化合物 在中药数据库中检索到88个“阴阳双补方”主要化合物，见表1（根据每味药OB值，仅列出排名前5的化合物）。

表1 阴阳双补方主要有效成分

2.2 阴阳双补方药物靶点 检索到阴阳双补方药物靶点有673个；将这些靶点导入Cytoscape3.8.2中，发现这些靶点网络由657个节点、11 253条边组成，同时使用cytoHubba插件筛选出排名前50的药物靶点，见图1。

图1 阴阳双补方Hub靶点

2.3 阴阳双补方潜在治疗靶点 在疾病基因数据库中检索到483个骨转移癌疾病基因、858个癌痛基因，将两种疾病基因与673个药物靶点进行映射，得到94个交集基因即潜在治疗靶点，见图2。在STRING11.5数据库中构建潜在治疗靶点PPI网络，见图3A；并在Cytoscape3.8.2中绘制“中药-化合物-潜在治疗靶点”网络图，见图3B；同时进行拓扑结构分析，根据节点拓扑指标Degree值，取排名前10的靶点绘制条形图，见图3C。

图2 阴阳双补方靶点、骨转移基因和癌痛基因的韦恩图

图3 阴阳双补方治疗癌痛潜在靶点的PPI网络（3A）、“中药-化合物-潜在治疗靶点”网络图（3B）及关键靶点（3C）

2.4 阴阳双补方治疗骨转移癌痛潜在靶点的GO功能分析 根据“FDR＜0.05”，得到100个符合条件的条目（BP 57个、CC 12个、MF 31个），主要涉及磷脂酰肌醇磷酸化、MAPK级联、质膜、伪足及丝氨酸、苏氨酸等各种激酶活性等，取各项排名前10的条目绘制气泡图，见图4。

图4 阴阳双补方治疗癌痛潜在靶点的GO功能富集分析

2.5 阴阳双补方治疗骨转移癌痛潜在靶点的KEGG功能分析 根据“FDR＜0.05”，得到70条符合条件的通路，主要包含PI3K-Akt、FoxO、ErbB及VEGF信号通路等，取排名前30的通路绘制气泡图，见图5。

图5 阴阳双补方治疗癌痛潜在靶点的KEGG通路富集分析

3 讨 论

现代医学认为骨转移癌痛的机制比较复杂，它包括炎症和神经病变等多个过程，涉及肿瘤微环境、骨细胞、激活的炎症细胞和骨神经支配神经元之间的各种相互作用［6］。中医学将癌痛的病机概括为“不通则痛”和“不荣则痛”：前者属实证疼痛，包含痰、瘀、寒、毒等；后者属虚证疼痛，病机多为正虚、阳虚。在临床实践中发现晚期恶性肿瘤骨转移患者多以正虚为本，故治疗上当注重扶正。根据李佩文教授经验化裁组成的阴阳双补方中以补骨脂、骨碎补补肾助阳，肉苁蓉补肾温阳，益精血，此外，骨碎补还可止痛，3药相辅相成，补肾阳止痛，共为君药；熟地黄滋补肾精，山茱萸肉、山药养肝补脾，俱为臣药；淫羊藿、透骨草益肾强骨，透骨草还兼有舒筋通络、活血止痛之效，两药合用，助君药温壮肾阳止痛之功。诸药合用，补肾之中兼顾养肝益脾，使肾精得充而虚损易复；温阳之中参以滋阴填精，则阳得阴助而生化无穷，共奏补肾助阳、益精止痛之效。

本研究通过构建“中药-化合物-潜在治疗靶点”网络图发现，槲皮素、山柰酚及木樨草素等为其核心化合物。其中槲皮素不仅可通过调节RANKL/RANK/OPG信号通路和炎症反应来抑制破骨细胞活化，减少骨癌疼痛模型中的骨质破坏，也可以通过调节PAR2/TRPV1信号通路来抑制骨癌疼痛中的外周/中枢致敏［7］。山柰酚可通过抑制白细胞介素-6（IL-6）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）等炎症因子的聚集，降低对机械刺激和热刺激的敏感性，从而有效缓解疼痛，这种镇痛作用可能与MrgprD含量降低有关［8］。木樨草素可以通过抑制Lewis肺癌诱导的骨癌痛中的p38 MAPK磷酸化来抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化以及NLRP3炎症小体，进而缓解骨痛［9］。

通过Cytoscape软件构建阴阳双补方治疗骨转移癌痛的互作网络图，发现VEGFA、STAT3、ErbB2及Akt1等为其关键靶点。其中VEGFA可通过诱导感觉神经元轴突生长和存活作用于感觉神经元，其受体VEGFR2在有髓A纤维和无髓C纤维感觉神经元上都有表达［10］，且在外周和中枢感觉神经系统中，当VEGFA外显子8可变剪接产生的VEGF-Axxxa增加、VEGFAxxxb表达降低时，VEGFR2即可被激活［11-12］。有研究认为VEGF-Axxxa可使C纤维机械敏感的伤害感受器敏感，导致疼痛信号的传递增加和机械性异常性疼痛的发展［11］。STAT3磷酸化在骨癌疼痛中有重要作用，其抑制剂DR-1-55可延迟自发和诱导伤害性行为的发生和严重程度，降低促炎细胞因子IL-6和白细胞介素-1β（IL-1β）的水平，因此认为靶向磷酸化STAT3可能是治疗癌痛的一种可行手段［13］。ErbB2可被高水平的NRG1激活，促进脊髓中小胶质细胞的生长，这可能导致损伤后的神经性疼痛［14-15］。研究认为当鞘内施用外源性NRG1时可上调ErbB2、p-ErbB2 mRNA和蛋白质水平、促进Akt1的激活，进而引发热痛觉过敏和机械异常性疼痛［16］。

通过富集分析发现，阴阳双补方治疗骨转移癌痛的作用机制主要与抗炎、镇痛、调节神经系统等有关。PI3K-Akt信号转导通路是体内重要的信号通路之一，该通路激活后可以诱导和维持不同程度的痛敏反应。有研究发现，当向乳腺癌骨转移疼痛模型大鼠鞘内注射Akt抑制剂GSK690693后，可降低脊髓中Akt磷酸化水平并抑制PI3K/Akt信号通路，进而缓解疼痛［17］。研究认为FoxO信号通路可以调节与疼痛或神经系统有关的凋亡活性［18］。VEGF可编码基因VEGF-A、PLGF-2和VEGF-B，这些基因可以通过激活感觉神经元中的VEGFR1来增强疼痛敏感性，而在同一模型中，阻断VEGFR1可以减轻癌痛［19］；在疼痛模型中，周围神经系统和脊髓中mTOR活化水平可上调［20］，当鞘内注射mTOR抑制剂雷帕霉素时，可减轻神经性疼痛［21］；同时，发现mTOR能够通过使HIF失调来调节VEGF信号通路［22］，故认为抑制mTOR/VEGF信号通路可以减轻神经性疼痛［23］。

综上所述，本研究首次运用中药网络药理学方法探索阴阳双补方治疗骨转移癌痛的多层次复杂网络结构，发现“阴阳双补方”可能通过槲皮素、山柰酚及木樨草素等核心化合物作用于VEGFA、STAT3、ErbB2及Akt1等关键靶点，进而调控PI3K-Akt、FoxO、VEGF及mTOR等信号通路，从而发挥抗炎、镇痛、调节神经系统等作用，对临床应用提供了一定的参考依据，也为其分子机制研究提供了新的思路。