杆状病毒凋亡抑制蛋白5在卵巢浆液性癌中的表达及意义

王 倩, 徐剑豪, 顾婷婷, 干文娟

(1. 苏州大学医学部, 江苏 苏州, 215000;2. 江苏大学附属昆山市第一人民医院 病理科, 江苏 昆山, 215300;3. 苏州大学附属独墅湖医院 病理科, 江苏 苏州, 215000)

卵巢癌是全球范围内第3大常见的妇科恶性肿瘤，且病死率高居妇科恶性肿瘤的第1位[1], 患者5年生存率低于45%[2]。浆液性癌是卵巢癌最常见的病理类型[3], 可分为卵巢高级别浆液性癌(HGSOC)和卵巢低级别浆液性癌(LGSOC), 而两者的临床预后相差甚远[4]。本研究从GEO数据库中下载GSE73638、GSE27651、GSE14001数据集，应用GEO2R在线分析工具筛选卵巢浆液性癌的差异表达基因(DEGs), 并对DEGs进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析，发现杆状病毒凋亡抑制蛋白5(BIRC5)是卵巢浆液性癌的关键分子。BIRC5属于细胞凋亡抑制蛋白家族成员[5], 是含有细胞凋亡重复(BIR)结构域的142个氨基酸的多功能小蛋白质[6]。已有众多研究发现BIRC5在乳腺癌[7]、肺腺癌[8]、胰腺癌[9]、尤文肉瘤[10]等多种肿瘤中过度表达，并与患者的预后密切相关[11], 但BIRC5在卵巢癌中的表达情况及潜在机制等尚有待进一步探索。本研究分析BIRC5在卵巢浆液性癌中的表达及病理意义，并初步探讨 BIRC5对卵巢浆液性癌发展过程的调控机制，以期为卵巢浆液性癌的个性化治疗、诊断和预后评估提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 生物信息学检测方法

1.1.1 数据集筛选: 从GEO数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)[12]中筛选人类HGSOC、LGSOC的芯片数据集，包括GSE73638、GSE27651和GSE14001数据集。GSE73638的平台是GPL20967, 包含13个HGSOC样本和7个LGSOC样本; GSE27651和GSE14001的平台是GPL570, GSE27651包含21个HGSOC样本和13个LGSOC样本, GSE14001包含10个HGSOC样本和10个LGSOC样本。

1.1.2 DEGs筛选: 以P<0.05和|logFC|>1为阈值，应用GEO2R在线分析工具对GSE73638数据集和GSE27651数据集的DEGs进行交集检测。由于上述阈值筛选到的DEGs有限，为了保证有足够的DEGs用于后续分析, GSE14001数据集中的DEGs仅以P<0.05为阈值进行检测。应用GSE14001数据库对第1次检测到的DEGs(GSE73638、GSE27651数据集的重叠DEGs)进行交集分析，再使用在线Venn软件获取数据集之间的重叠DEGs。

1.1.3 DEGs的GO和KEGG富集分析: 应用WebGestalt在线分析工具对DEGs进行GO和KEGG通路富集分析，并用R软件(ggplot2包)绘制结果，P<0.05为差异具有统计学意义。

1.1.4 蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络构建和关键基因筛选: 首先，应用String在线工具(http://string-db.org)对重叠DEGs构建PPI网络(设置相互作用得分>0.700); 然后，应用Cytoscape软件的插件MCODE根据拓扑结构对给定的网络进行聚类，从而找到紧密连接的区域; 最后，应用Cytoscape软件的另一个插件程序CytoHubba以Radiality算法对顶级节点进行排序，筛选前10个关键基因。

1.1.5 关键基因与预后的关系分析: 通过GEPIA数据库(http://gepia.cancer-pku.cn/index.html)验证关键基因在卵巢癌组织和癌旁组织中的表达水平，并分析关键基因与卵巢癌患者总体生存情况和分期的相关性。

1.2 临床标本收集

收集2014年1月—2021年8月在昆山市第一人民医院接受手术治疗的58例卵巢浆液性癌患者的卵巢癌组织(石蜡包埋)，包括38例HGSOC和20例LGSOC(分别纳入HGSOC组和LGSOC组)，病理诊断参照国际癌症研究机构发布的2014版世界卫生组织(WHO)女性生殖系统肿瘤分类。所有患者术前均未接受放疗和化疗，且临床病理资料完整。根据国际妇产科联盟(FIGO)2014年分期标准对卵巢浆液性癌组织标本进行病理分期。

1.3 免疫组织化学检测方法

BIRC5、Ki-67和TP53蛋白检测采用免疫组织化学GTvisionTM二步染色法。兔抗人BIRC5单克隆抗体(货号GT204802，即用型)、鼠抗人Ki-67单克隆抗体(货号GT209429, 即用型)、鼠抗人TP53单克隆抗体(货号GM700102, 即用型)均购自上海基因科技公司，二氨基联苯胺(DAB)试剂购自上海基因科技公司，用已知阳性组织作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照，检测步骤按照试剂盒说明书进行。以出现棕黄色颗粒为阳性, BIRC5阳性反应定位于细胞膜和细胞浆, Ki-67、TP53阳性反应定位于细胞核，背景无染色。采用Allred评分法[13]对BIRC5、TP53免疫组织化学检测结果进行分级: ① 染色强度，阴性为0分、弱棕黄色为1分、中等棕黄色为2分、强棕黄色为3分; ② 阳性细胞所占比例, 0～1/100为1分、>1/100～1/10为2分、>1/10～1/3为3分、>1/3～2/3为4分、>2/3为5分。总积分为染色强度评分与阳性细胞所占比例评分相加所得, 0～2分为阴性，≥3分记为阳性。Ki-67表达水平的判定以20%阳性肿瘤细胞为临界值, ≤20%为低表达, >20%为高表达。

1.4 统计学分析

采用SPSS 22.0统计学软件处理数据，不同临床病理特征的卵巢浆液性癌患者BIRC5蛋白表达情况比较采用卡方检验。绘制受试者工作特征(ROC)曲线，评价BIRC5、Ki-67、TP53对LGSOC与HGSOC的鉴别诊断价值。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 生物信息学检测结果

Venn图显示, GSE73638数据集与GSE27651数据集的重叠DEGs包括157个上调基因和204个下调基因(图1A)，进一步应用GSE14001数据集对上述重叠DEGs进行交集分析，最终得到79 个上调基因和85个下调基因(图1B)。

A: GSE73638、GSE27651数据集的重叠DEGs; B: GSE14001数据集与GSE73638+GSE27651数据集的重叠DEGs。图1 GSE73638、GSE27651和GSE14001数据集重叠DEGs的Venn图

本研究先利用String数据库构建重叠DEGs的PPI网络(图2A)，再应用Cytoscape软件进行可视化分析并构建出一个包括115个节点和894条边的 PPI 网络(图2B); 应用MCODE插件将PPI网络分为4个模块(图2C), 第1个模块有38个节点和661条边(MCODE得分35.730分)，第2个模块有7个节点和21条边(MCODE得分7.000分)，第3个模块有5个节点和10条边(MCODE得分5.000分), 第4个模块有3个节点和3条边(MCODE得分3.000分); 应用CytoHubba插件筛选出前10个Hubba节点，即BIRC5、CDC20、CDK1、CDKN3、MKI67、NUSAP1、RRM2、TOP2A、TPX2和UBE2C基因，以便使用径向拓扑技术进一步研究(图2D)。

A: String数据库中重叠DEGs的PPI网络; B: Cytoscape软件建立的PPI网络; C: MCODE插件拆分的PPI网络的4个模块; D: CytoHubba插件筛选出的关键基因。图2 PPI网络构建和关键基因筛选结果

GEPIA数据库分析结果显示，10个关键基因中，仅BIRC5与卵巢癌患者总体生存情况相关。GEPIA在线网站包含了TCGA数据库中的426例卵巢癌组织和8例癌旁组织的信息，相较于癌旁组织,BIRC5在卵巢癌组织中高表达，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3A; Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期卵巢癌的BIRC5表达水平依次呈下降趋势，但组间差异无统计学意义(F=2.314,P=0.109), 见图3B; TCGA数据库分析结果提示,BIRC5表达与卵巢癌患者的总生存期呈正相关(P=0.014), 即BIRC5表达水平越高，卵巢癌患者的总生存期越长，见图3C。

A: BIRC5在卵巢癌组织(n=426)和癌旁组织(n=8)中的表达水平; B: BIRC5表达与卵巢癌分期的关系; C: BIRC5低表达与高表达患者的生存分析。图3 基于GEPIA数据库分析BIRC5与卵巢癌分期和总生存期的相关性

GO和KEGG富集分析结果显示, 164个DEGs主要富集在有丝分裂细胞周期、细胞器分裂、核分裂等生物学过程(图4A)和癌症相关的微小RNA等通路(图4B)中。

A: GO富集分析的前10个生物学过程; B: KEGG通路富集分析的前10个通路。图4 HGSOC和LGSOC重叠DEGs的GO和KEGG通路富集分析结果

2.2 BIRC5蛋白在癌组织和癌旁组织中的表达情况

免疫组织化学检测结果显示, LGSOC组中，癌组织的BIRC5蛋白阳性表达率与癌旁组织比较，差异无统计学意义(χ2=1.026,P=0.311); HGSOC组中，癌组织的BIRC5蛋白阳性表达率高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=44.333,P<0.001)。见表1。

表1 BIRC5蛋白在卵巢癌组织及癌旁组织中的表达[n(%)]

2.3 卵巢癌组织中BIRC5、TP53和Ki-67蛋白表达情况

观察LGSOC、HGSOC的苏木素-伊红(HE)染色形态表现和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫组织化学表达情况，结果显示，BIRC5、TP53和Ki-67蛋白在HGSOC癌组织中高表达，在LGSOC癌组织中低表达，见图5。

图5 HGSOC、LGSOC的HE染色形态表现和BIRC5、TP53、Ki-67蛋白免疫组织化学染色图(GTvisionTM二步染色法,放大100倍)

2.4 卵巢浆液性癌患者BIRC5蛋白表达与临床病理特征的关系

HGSOC患者的BIRC5蛋白阳性表达率高于LGSOC患者，年龄>60岁、FIGO分期Ⅲ～Ⅳ期、Ki-67蛋白>20%患者的BIRC5蛋白阳性表达率分别高于年龄≤60岁、FIGO分期Ⅰ～Ⅱ期、Ki-67蛋白≤20%的患者，差异均有统计学意义(P<0.05); 不同糖类抗原125水平、不同TP53蛋白表达情况患者的BIRC5蛋白表达情况比较，差异无统计学意义(P>0.05), 见表2。由此提示，卵巢浆液性癌患者BIRC5蛋白表达情况与年龄、FIGO分期、Ki-67蛋白表达和病理类型相关(P<0.05)，与糖类抗原125、TP53蛋白表达无关(P>0.05)。

表2 不同临床病理特征的卵巢浆液性癌患者BIRC5蛋白表达情况比较[n(%)]

2.5 BIRC5、Ki-67、TP53对卵巢浆液性癌的诊断价值

ROC曲线分析结果显示, BIRC5、Ki-67鉴别诊断LGSOC与HGSOC的曲线下面积(AUC)分别为0.909、0.931, 均大于TP53的0.790, 见表3、图6。

表3 BIRC5、Ki-67、TP53对卵巢浆液性癌的诊断价值

图6 BIRC5、Ki-67、TP53鉴别诊断LGSOC与HGSOC的ROC曲线

2.6 LGSOC、HGSOC患者的生存预后分析

HGSOC组患者的总体生存率低于LGSOC组，但差异无统计学意义(χ2=3.522,P=0.061), 见表4。根据BIRC5蛋白检测结果将58例卵巢浆液性癌患者分为BIRC5阳性组和BIRC5阴性组，每组29例。BIRC5阳性组患者与BIRC5阴性组患者的总体生存率比较，差异无统计学意义(χ2=1.074,P=0.300), 见表5。

表4 LGSOC、HGSOC患者的预后结局比较[n(%)]

表5 BIRC5阳性、BIRC5阴性卵巢浆液性癌患者的预后结局比较[n(%)]

3 讨 论

卵巢癌是临床常见的女性生殖道恶性肿瘤，居全球女性癌症相关死亡原因的第8位[2]。近年来，卵巢癌的诊断、治疗和预后判断方面并无显著改善[14], 因此亟需寻找可用于卵巢癌诊断、治疗和预后评估的分子标志物。BIRC5又称Survivin，定位于人类染色体17q25位点，是细胞凋亡抑制蛋白家族的成员，可抑制细胞凋亡。研究[15]表明, BIRC5受到染色体区域维持因子1(CRM1)的正向调控，促进了卵巢癌的发展。YIN S N等[16]对卵巢癌 OVDM1细胞系进行生物信息学分析，证实BIRC5在卵巢癌中具有关键作用。HE X Y等[17]进行Meta分析发现，BIRC5高表达与卵巢癌FIGO分期密切相关。OZRETIC P等[18]发现, Hedgehog信号通路与卵巢癌的病理分型有关，且BIRC5是该通路的一个新靶点。WANG B J等[19]也利用原位卵巢癌小鼠模型验证了微小RNA-203(miR-203)通过靶向BIRC5抑制上皮间质转化(EMT), 进而抑制卵巢肿瘤转移。

本研究通过GEO数据库分析了HGSOC和LGSOC的3个数据集(GSE73638、GSE27651和GSE14001数据集)，共获得164个重叠DEGs, 进一步行GO和KEGG功能富集分析发现BIRC5是卵巢浆液性癌的关键基因; GEPIA生物信息学网站分析结果显示,BIRC5基因与卵巢癌患者总体生存情况相关，即BIRC5表达越高，卵巢患者的生存周期就越长; 与癌旁组织相比,BIRC5在癌组织中的表达水平显著更高。本研究分析临床标本后发现, BIRC5蛋白在卵巢癌组织中的表达水平相较癌旁组织中显著升高，且BIRC5表达与卵巢浆液性癌患者FIGO分期和Ki-67表达密切相关，即BIRC5高表达可能提示癌细胞出现浸润、转移或复发，肿瘤恶性程度高，患者预后差。本研究还发现，BIRC5阳性组患者与BIRC5阴性组患者的总体生存率虽无统计学差异，但BIRC5阳性组患者生存情况呈现劣于BIRC5阴性组患者的趋势，与基于TCGA肿瘤样本的GEPIA数据库分析结果不一致。考虑原因如下: 首先，本研究样本量有限(卵巢浆液性癌58例)，分可能存在选择偏倚; 其次，数据库BIRC5表达数据为mRNA水平，而非蛋白质水平，因此需考虑BIRC5转录后调控的情况，而本研究是通过免疫组织化学法检测样本的BIRC5蛋白质表达量，更为准确; 最后，数据库检测的癌组织中不仅包括癌成份，还含有很多间质成分如炎细胞、成纤维细胞等，因此BIRC5表达数据不能完全等同于癌组织的BIRC5表达情况，而本研究通过免疫组织化学法检测样本BIRC5水平，可在显微镜下精准测量癌成份的BIRC5表达，更为准确。

相关研究[20]指出，细胞核分裂增殖指标Ki-67可作为卵巢浆液性癌的预后指标。TP53常被用作鉴别诊断HGSOC和LGSOC的免疫组织化学指标，且SU D等[21]发现TP53突变可促进卵巢浆液性癌的发生与发展。本研究发现, BIRC5、Ki-67在卵巢浆液性癌中均呈高表达，且BIRC5、Ki-67鉴别诊断LGSOC与HGSOC的AUC相似，均优于TP53的AUC, 提示BIRC5未来或可作为诊断卵巢癌的新指标。本研究中，HGSOC组患者的总体生存率低于LGSOC组，但差异无统计学意义，这可能是因为本研究样本数量较少。本研究还发现, BIRC5表达与Ki-67表达有关，与TP53表达无关，提示BIRC5可能是通过调控Ki-67表达而非TP53信号通路来促进卵巢癌的发生与发展，也提示BIRC5属于一种促癌基因。本研究存在一定局限性，例如样本量偏少，且未明确研究BIRC5对卵巢浆液性癌的具体调控机制，未来有待进一步深入探讨。

综上所述,BIRC5是卵巢浆液性癌的关键基因，可作为该疾病诊断和生存预后判断的新指标。BIRC5属于促癌基因，可能通过调控Ki-67表达而非TP53信号通路促进卵巢浆液性癌的发生与发展。