长链非编码RNA HAGLROS在胃癌中的生物信息学分析

吴 鹏, 冯 锋, 胡道卿, 江家星, 王志宁

(南京明基医院/南京医科大学附属明基医院 肿瘤科, 江苏 南京, 210019)

2020年全球癌症统计数据显示，胃癌的发病率和病死率在全球范围内分别排第5位和第4位[1]。中国是胃癌高发国家，2020年胃癌的发病率和病死率均居恶性肿瘤的第3位[2]。长链非编码RNA(LncRNA)是一类大小在200核苷酸以上、缺少开放阅读框、无蛋白质编码功能的RNA。研究[3]发现, LncRNA在多种恶性肿瘤中异常表达，可参与肿瘤的增殖、侵袭转移、代谢、免疫、耐药等过程。一些LncRNA被证实在胃癌的发生发展、侵袭转移等过程中起着重要的作用，可作为胃癌诊断和预后的潜在标志物及治疗靶点[4]。本课题组前期研究发现LncRNA HAGLROS在胃癌中高表达，能通过激活mTOR通路和抑制自噬促进胃癌细胞的增殖、侵袭和转移。研究[5]发现, HAGLROS不仅能通过竞争性地吸附微小RNA-100-5p(miR-100-5p)使mTOR表达上调，而且能通过绑定mTORC1复合物激活mTORC1信号转导通路抑制自噬，从而维持胃癌细胞的恶性表型。

近年来研究[6]证实HAGLROS可参与胃癌、肝癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌等多种肿瘤的恶性发展过程。WEI H M等[7]发现, HAGLROS能通过调控miR-5095/ATG12轴和PI3K/AKT/mTOR信号促进肝癌细胞的增殖，抑制凋亡及增强自噬。因此, HAGLROS在肿瘤的诊断、治疗中有广阔的应用前景，但目前的研究仍不够深入，文献检索HAGLROS在肿瘤中的研究目前仅有24篇，在胃癌中的研究极少，有待进一步的挖掘和探索。本研究采用生物信息学的方法结合公共数据库研究HAGLROS在胃癌中的潜在功能和机制，为基础实验及临床研究提供一定的理论依据，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 应用公共数据库分析HAGLROS在胃腺癌中的表达

应用UCSC Xena数据库(https://xenabrowser.net/)分析LncRNA HAGLROS在胃癌和正常胃黏膜组织中的表达水平。采用四分位数法将HAGLROS分为高表达组(>75%)和低表达组(<25%), 采用Log-rank检验和Kaplan-Meier检验对HAGLROS进行生存分析,P<0.05为差异有统计学意义。

1.2 应用肿瘤与癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析HAGLROS的共表达基因

从TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)下载胃癌基因表达谱。采用R语言分析HAGLROS的共表达基因(选取的是蛋白质编码基因)，筛选标准为Pearson相关系数绝对值>0.3且P<0.01。采用R软件的clusterProfiler包对共表达基因进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析并绘图,P<0.05表示富集结果显著。应用Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)和WebGestalt(http://www.webgestalt.org/)在线数据库对共表达基因进行功能富集分析。

1.3 HAGLROS共表达基因的网络互作分析及关键基因的筛选

应用STRING数据库(https://cn.string-db.org/)进行HAGLROS共表达基因的蛋白质互作(PPI)网络分析，再导入Cytoscape软件中进行PPI网络可视化处理，然后使用cytoHubba插件对PPI网络中的基因进行节点得分计算，并依据排名筛选关键基因。运用UALCAN数据库(http://ualcan.path.uab.edu/)分析目的基因在胃腺癌及正常胃黏膜组织中的表达情况以筛选差异表达(P<0.01)的基因。

1.4 预测与HAGLROS相互作用的微小核糖核酸(miRNA)

应用miRDB(http://mirdb.org/)、LncBase(http://carolina.imis.athena-innovation.gr/diana_tools/web/index.phpr=lncbasev2%2Findex)、RNAhybrid(https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/)这3个在线数据库预测可能与HAGLROS结合的miRNA, 并取交集。利用UALCAN在线数据库分析各miRNA在胃腺癌中的表达水平。

1.5 预测miRNA的下游靶基因

运用R软件在miRDB、miRTarBase、TargetScan这3个数据库中对预测及筛选得到的miRNA进行下游靶基因的预测，并取交集，选择3个数据库均能预测得到的靶基因进行下一步的研究。采用Cytoscape软件对内源竞争RNA(ceRNA)关系进行绘图。

1.6 miRNA下游靶基因的功能富集分析

采用Metascap(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)在线数据库对miRNA的下游靶基因进行功能富集分析。

1.7 对miRNA下游靶基因和共表达基因取交集

将1.5步骤中预测得到的miRNA下游靶基因与1.2步骤中得到的HAGLROS共表达基因取交集，并建立LncRNA-miRNA-mRNA轴。

2 结 果

2.1 HAGLROS 在胃腺癌中的表达水平及生存分析

通过UCSC Xena数据库分析发现, HAGLROS在胃腺癌中的表达水平高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.001)。对HAGLROS进行的生存预后分析结果显示，随着HAGLROS表达量的升高，胃癌患者的总生存期(OS)下降，差异有统计学意义(P<0.001), 见图1。

2.2 HAGLROS的共表达基因及其GO分析和KEGG通路分析

采用R语言分析HAGLROS的共表达基因(选取的是蛋白质编码基因)，共获得301个。采用R语言对这301个基因进行KEGG通路富集分析发现，其主要与乳腺癌、黑色素瘤、Rap1信号通路、Wnt信号通路、干细胞多能性调控信号通路、鞘脂类信号通路、肌动蛋白细胞骨架调节、胃癌、MAPK信号通路、PI3K-Akt信号通路等相关，见图2。采用Metascape数据库进一步行共表达基因的功能富集分析，发现其主要参与胚胎和器官的生长发育、神经和突触生长、细胞组分形态发生等生物学过程以及Wnt信号通路、神经系统等相关通路，见图3。为进一步分析HAGLROS共表达基因的生物学过程，采用WebGestalt数据库进行GO富集分析，发现其主要与神经前体细胞增殖、感觉器官形态发生、突触囊泡循环及介导的转运、中枢神经系统神经元分化、Notch信号通路、胚胎器官发育、跨膜受体蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶信号转导、突触前等有关，与Metascape数据库分析结果基本一致，见图4。

图2 HAGLROS共表达基因的KEGG富集分析

图3 HAGLROS共表达基因的功能富集分析(Metascape)

图4 HAGLROS共表达基因的GO分析(WebGestalt)

2.3 HAGLROS共表达基因的网络互作分析及其关键基因的筛选

采用STRING数据库构建HAGLROS共表达基因的PPI网络，将置信度设置为大于0.4, 得出由300个蛋白节点和294对互作关系组成的网络。将数据导入Cytoscape软件中构建PPI网络图，利用cytoHubba插件进行拓扑结构分析，共有12种方法，其中Degree和MCC是最常用的方法，将2种方法排名前30位的基因取交集，得出23个基因，输入STRING数据库中，见图5。通过蛋白注释发现，大多数基因与胚胎生长发育及神经生长相关，其中FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、SALL4、GBX2、TBX2、SNAI1可参与胚胎生长发育;NES、FGF8、FGF3、FGF17、FGF19、ZIC1、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5、TUBB3、CAMK2B、PCLO、GBX2、DRD2、SALL4可参与神经发育生长、轴突突触形成或神经递质的释放与传递。

图5 23个关键基因的网络图

为进一步缩小关键基因范围，本研究将Degree和MCC排名前10位的基因取交集，得到FGF8、NES、FGF3、SYN1、SYN2、DLX1、DLX2、DLX5。在UALCAN数据库中分析这8个基因在胃腺癌中的表达情况，发现NES、FGF8、FGF3在胃腺癌中表达高于正常胃黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.001), 见图6, 而且他们在cytoHubba插件的12种算法中的得分排名基本也是最靠前的。共表达分析结果显示,NES、FGF8、FGF3在胃癌中与HAGLROS的Pearson相关系数分别为0.37、0.447、0.354, 见图7。由此可见,NES、FGF8、FGF3可能与HAGLROS的关系最为密切，并以一定的方式与 HAGLROS联系并通过调控相关通路促进胃癌的发生、发展。

A: NES基因的表达情况; B: "FGF8基因的表达情况; C: FGF3基因的表达情况。图6 关键基因在胃癌及正常组织中的表达

A: NES基因与HAGLROS的共表达情况(相关系数=0.37, P=1.222e-14); B: FGF8基因与HAGLROS的共表达情况(相关系数=0.447, P=2.078e-21); C: FGF3基因与HAGLROS的共表达情况(相关系数=0.354, P=1.959e-13)。图7 关键基因与HAGLROS的共表达关系

2.4 分析HAGLROS结合的miRNA并预测miRNA下游靶基因

应用miRDB、LncBase、RNAhybrid这3个数据库预测能与HAGLROS结合的miRNA，并取交集，得出3个数据库均能预测出的miRNA共16个: hsa-miR-1297、hsa-miR-4750-3p、hsa-miR-6749-3p、hsa-miR-548f-5p、hsa-miR-1976、hsa-miR-548g-5p、hsa-miR-548aj-5p、hsa-miR-548x-5p、hsa-miR-6727-3p、hsa-miR-5197-5p、hsa-miR-5691、hsa-miR-4257、hsa-miR-6776-5p、hsa-miR-6805-3p、hsa-miR-6892-3p、hsa-miR-548aw。通过UALCAN数据库分析上述16个miRNA在胃腺癌中的表达情况，发现其中4个miRNA在胃腺癌中表达，即hsa-miR-1976、hsa-miR-6805、hsa-miR-6892、hsa-miR-548aw。应用miRDB、miRTarBase、TargetScan这3个数据库预测这4个miRNA的靶基因，并取交集，发现共有124个靶基因可以通过这3个数据库同时预测得出，其中hsa-miR-1976的靶基因有27个, hsa-miR-6892-3p有11个, hsa-miR-548aw有86个。hsa-miR-6805-3p的靶基因在这3个数据库中未取得交集。采用Cytoscape软件绘制ceRNA网络图，见图8。

图8 ceRNA网络构建

2.5 miRNA下游靶基因的功能富集分析

利用Metascape在线数据库对上述得到的miRNA的124个靶基因进行功能富集分析，发现主要与Kaiso-NCOR蛋白复合物、神经前体细胞增殖、脂质生物合成过程的正向调控、肌动蛋白纤维组织、蛋白质分解代谢过程、管形态发生、神经系统发育调节、磷脂生物合成过程、细胞分化的负调控等生物学过程及SMAD2/3和SMAD4转录活性下调、Wnt信号通路与多能性、mTOR信号通路、Fcγ受体介导的吞噬作用、冠状病毒感染中的内质网应激反应、T17细胞分化、甲状腺激素信号通路等信号通路有关。见图9。

图9 miRNA下游靶基因的功能富集分析(Metascape)

2.6 miRNA下游靶基因与HAGLROS共表达基因取交集

采用R软件将124个靶基因与HAGLROS的301个共表达基因取交集，绘制韦恩图，得出1个基因ORAI2,ORAI2是上述预测得到的3个miRNA中miR-1976的靶基因，见图10。运用GEPIA数据库对ORAI2进行分析，发现ORAI2在胃腺癌中高表达，差异有统计学意义(P<0.01); 在共表达关系中, HAGLROS与ORAI2的Pearson相关系数为0.321, 见图11。通过查阅文献，发现ORAI2基因编码的蛋白质是细胞膜上钙通道ORAI蛋白的一个亚基，在钙离子内流过程中发挥重要的作用，而钙离子通道的功能异常与肿瘤的增殖、侵袭、转移、血管生成、免疫抑制、耐药等过程密切相关[8]。由此推断, HAGLROS-miR-1976-ORAI2轴可能参与调控胃癌的发生发展过程，需要后续实验的进一步论证。

图10 miRNA下游靶基因与HAGLROS共表达基因取交集

A: ORAI2在胃癌中高表达; B: ORAI2与HAGLROS的共表达关系。图11 ORAI2在胃癌中高表达及与HAGLROS的共表达关系

3 讨 论

本研究发现HAGLROS在胃腺癌中的表达较正常胃黏膜组织显著升高，生存分析显示HAGLROS低表达患者的OS较高表达患者显著延长。在下载胃腺癌的TCGA数据库后，利用R语言分析得出HAGLROS的共表达基因共301个; KEGG通路分析发现，共表达基因主要涉及Rap1、Wnt、干细胞多能性调控、MAPK、PI3K-Akt等信号通路及胃癌、乳腺癌、黑色素瘤等癌症; 进一步采用Metascape、WebGestalt数据库分析发现，共表达基因主要参与胚胎和器官的生长发育、神经和突触生长等生物学过程以及Wnt、Notch等相关通路; 对共表达基因进行PPI分析及关键基因筛选，发现关键基因与胚胎生长发育及神经生长密切相关，并得出与HAGLROS关系最为密切的3个基因，即NES、FGF8、FGF3。综合上述结果，本研究推断HAGLROS在胃癌中可能与胚胎和器官的生长发育、神经和突触生长等生物学过程以及Wnt、Notch、干细胞多能性调控等通路相关，而NES、FGF8、FGF3可能是HAGLROS调控胃癌发生发展过程中的最关键的3个基因，并需要进一步的基础研究和实验论证。

本研究分析得出HAGLROS在胃癌中可能与胚胎和器官的生长发育有关。早期研究[9]显示，肿瘤的生物学行为与早期胚胎发育存在相似性，包括肿瘤的侵袭性与胚胎植入、两者的基因和蛋白质水平以及免疫逃避途径等方面。肿瘤细胞在胚胎微环境中可失去恶性表型而参与正常组织分化，而胚胎离开其发育的微环境则可产生恶性肿瘤[10]。钟艳平等[11]提出了肿瘤发生的“二元论”，一个途径为正常胚胎和个体发育过程中因分化受阻而产生相应的分化型肿瘤，另一个途径为成熟体细胞在压力因素下通过启动“逆向分化”形成多倍体肿瘤巨细胞(PGCCs)而获得多能干性，启动内周期和内分裂，这一阶段类似于胚胎发育最早期的卵裂阶段，但因未经历正常有性生殖过程中种植的程序，最终产生各种高核级肿瘤。

本研究还得出一个重要的结论，即HAGLROS可能与胃癌中神经生长有关。既往研究[12]认为肿瘤中存在周围神经浸润，即肿瘤细胞在现有神经周围的生长和浸润。近年来研究发现，肿瘤中还存在新生的神经和轴突[13]。2017年, MAUFFREY P等[14]研究发现，小鼠脑室下区的神经祖细胞可透过血脑屏障迁移至肿瘤和转移灶，分化为肾上腺素能神经，而肿瘤干细胞推动了神经的再生。2020年, AMIT M等[15]研究发现，p53敲除或突变的口腔鳞状细胞癌细胞外囊泡内miR-34a水平的降低促进了肿瘤内感觉神经的生成，并诱导这些神经分化为肾上腺素能神经。肿瘤还可分泌神经营养因子、轴突导向分子及细胞外囊泡而诱导神经轴突的发生。研究[13]表明，肿瘤中新生神经可能受交感和副交感神经的支配调节以促进肿瘤内新生血管的形成、肿瘤细胞的化疗耐药及免疫逃逸等，进而促进肿瘤的生长。研究[15]发现miRNA可参与肿瘤内新生神经的生长，但LncRNA还需要进一步的挖掘和研究。本研究发现Wnt信号通路可能是HAGLROS促进胃癌发生发展的重要通路。Wnt信号通路在胚胎器官发育、神经系统发育、干细胞的更新分化等过程中起关键的作用[16]。另外, Notch、干细胞多能性调控信号通路也在胚胎发育、干细胞分化过程中起着重要的作用。

NES、FGF3、FGF8是本研究分析得出的与HAGLROS关系最密切的3个基因。NES又称Nestin, 是一种细胞骨架相关的Ⅵ类中间丝蛋白，是神经干细胞的特征性标志物[17]。NES与肿瘤增殖、侵袭转移和预后较差有关，且特异性地表达于肿瘤新生血管中[18]。FGF3、FGF8是成纤维细胞生长因子(FGF)家族的成员, FGFs通过结合其受体FGFRs, 激活下游多种信号通路，在胚胎发育、血管生成及肿瘤的上皮间质转化(EMT)、复发、耐药等过程中起着重要的作用[19]。研究[20]表明, FGF8、FGF3在前脑神经嵴、中脑后脑屏障等表达, FGF8在胚胎神经干细胞的分化和发育、神经活动过程中发挥重要的作用。此外，上述23个关键基因中, SALL4也是一种肿瘤干细胞基因，在维持胚胎早期发育、器官形成、胚胎干细胞自我更新和多能性方面起着重要的作用[21]。综合上述分析，本研究推断HAGLROS在胃癌中可能与胚胎器官生长发育、神经生长等生物学过程有关，而这些过程可能由肿瘤干细胞基因、神经干细胞基因等介导，进而通过调控Wnt、Notch、干细胞多能性调控等信号通路，影响胃癌的发生发展。

本研究采用生物信息学的方法预测与HAGLROS相结合的miRNA及其下游靶基因，并对靶基因进行功能富集分析，发现参与的生物学过程包括神经生长发育、细胞分化，相关通路包括Wnt信号通路与多能性、mTOR信号通路，这与HAGLROS共表达基因的富集分析中神经生长生物学过程及Wnt、干细胞多能性调控通路有一定的重合。为增加下游靶基因的准确性，本研究将其与HAGLROS的共表达基因取交集，得到ORAI2, 构成了HAGLROS-miR-1976-ORAI2轴。ORAI2是ORAI家族的一个亚型, ORAI蛋白位于细胞膜，与内质网膜上的基质反应蛋白(STIM)形成钙释放激活钙通道(CRAC), 促进钙池操纵性钙内流(SOCE), 调节细胞内钙的稳态[22]。研究[23]发现, ORAI的异常表达可导致钙内流的失调，参与肿瘤的增殖、侵袭转移等过程。WU S Y等[24]研究发现, ORAI2在胃癌及转移淋巴结中高表达，与肿瘤的低分化、侵袭、淋巴结转移和较差的预后有关，其能通过PI3K/Akt信号通路和MAPK依赖的黏着斑解离途径促进胃癌细胞的增殖和转移。

综上所述，本研究运用生物信息学的方法预测并筛选HAGLROS在胃癌中的关键靶基因，分析HAGLROS参与胃癌的生物学过程及调控通路，并建立HAGLROS-miRNA-mRNA网络，为HAGLROS在胃癌中的进一步研究提供新的思路和方向。