斑马鱼环状RNA研究进展

周春红，卢子滨

南方医科大学中医药学院国家中医药管理局科研三级实验室中药药理实验室，广州 510515

环状RNA(circular RNA，circRNA)是一类广泛表达于真核生物中，且高度保守的小分子RNA[1]。circRNA可通过不同方式参与调控亲本基因的表达，或充当miRNA和RNA结合蛋白(RNA-binding proteins，RBPs)“海绵”调节下游靶基因蛋白的表达等，在各种生物学过程中都发挥着重要的调控作用[2- 4]。

模式生物斑马鱼作为一种小型水生动物，与人类之间大约有70%的基因是直系同源的[5]。斑马鱼特有的透明胚胎可用于实时监测胚胎发育的过程，展开各种病理生理现象的研究。斑马鱼还具有繁殖周期短、养殖费用相对较低、可用于高通量药物筛选的独特优势，在医药研究领域应用日益广泛[6]。因此人们试图从斑马鱼的组织中鉴定并表征circRNA[7]，发掘斑马鱼体内与人类基因同源的circRNA，以利用斑马鱼自身优势，开展与circRNA相关的更高效、深入的疾病研究。

circRNA的分类和特征

circRNA的分类circRNA为闭合环状结构，可由前体RNA(pre-mRNA)通过反向剪接形成[8]。根据circRNA形成过程中pre-mRNA的剪接方式，可将circRNA分为3类：(1)内含子circRNA(intronic circRNA，ciRNA)；(2)外显子circRNA(exonic circRNA，EciRNA)；(3)内含子、外显子共同组成的circRNA(exonic-intronic circRNA，EIciRNA)[9-10]。circRNA形成的机制十分复杂，目前研究较多的假说有：套索驱动的循环化假说、RBP驱动的环化假说和配对环状内含子RNA驱动的环化假说等[11-13]。

circRNA的特征(1)与线性RNA不同，circRNA为闭合的环状结构。不具备5’- 3’极性及聚腺苷酸化尾巴，故而不易被RNA核酸外切酶或核糖核酸酶R(RNase R)降解，比线性RNA更为稳定[14]。(2)circRNA主要存在于细胞质中，且以EciRNA为主，还可能具有miRNA反应元件(miRNA response element，MRE)[15]。(3)circRNA在真核细胞中广泛表达，且种类众多。(4)EIciRNA主要位于细胞核内，参与基因的表达，其内含子一般位于两个外显子之间[16]。(5)circRNA的分布具有组织特异性[17]。

circRNA的生物学作用随着生物技术的快速发展，人们在多种生物体内均检测到大量circRNA的存在，并发现其广泛参与了多种生理病理过程，具有重要的生物学作用[18]。现已明确的circRNA的生物学功能有：(1)参与调控亲本基因的表达过程。如EIciRNA通常位于细胞核内，通过顺式作用方式与U1小核糖核蛋白相互作用，进而增强其亲本基因的转录活性[19]。此外，circRNA也可与磷酸化的RNA聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNA PolⅡ)相互作用来调控基因的表达[20]。不仅如此，主要定位于细胞核内的ciRNA，也能参与基因转录的调控[21]。(2)与miRNA或RBPs相互作用，发挥“海绵”作用。circRNA具有MRE，能与miRNA竞争性地与其下游靶基因mRNA上的3’非翻译区域(3’-untranslated region，3’UTR)结合，从而参与调节miRNA对下游靶基因转录后的负调控过程，抑制靶标基因mRNA的降解。故circRNA又称为竞争性内源性RNA(competing endogenous RNA，ceRNA)[22]。circRNA还可与RBPs结合，发挥RBPs海绵作用，从而参与生命活动的各个过程[23- 24]。后者与维持RNA结构的稳定性、RNA的转运及翻译和选择性剪接等多种生物学过程密切相关，在转录后基因表达调控中发挥重要作用[25](图1)。

斑马鱼中的circRNA

斑马鱼中circRNA的鉴定与表征Shen等[26]对斑马鱼中的3868个circRNA进行了鉴定和表征，发现大多数斑马鱼circRNA有一个或两个作用于同一靶标miRNA的位点，多个circRNA共同作用于同一miRNA，例如circRNA000207、circRNA000348、circRNA000423等29个circRNA均可充当dre-miR- 2193海绵，进而通过相互作用形成复杂的调控网络图。此外，斑马鱼29%的circRNA与人类、小鼠和豚鼠都具有同源性，包括一些高度保守的circRNA，如：circRNA000348、circRNA000207和circRNA000423等。另有研究也表明这些circRNA在人类和小鼠中是保守的，它们可能在脊椎动物中也发挥着相似的功能[27]。与哺乳动物中circRNA的生物发生机制不同，斑马鱼中只有2.64%外显子circRNA符合内含子对驱动环化模型的条件，表明斑马鱼的circRNA可能通过不同的机制环化形成。在此基础之上，刘丽丽[28]又进一步对斑马鱼胚胎中的32 949个circRNA的表达特征进行分析，在一定程度上丰富了斑马鱼circRNA数据库。研究发现斑马鱼circRNA主要分布于8号、9号、15和19号染色体，且其中69%来源于外显子，6%来源于内含子，其余的则是来源于基因间序列。同时斑马鱼circRNA多数长度在3200 nt以内，且长度越长则数量越少。通过对成年斑马鱼中的3428个circRNA进行鉴定分析发现，circRNA分布在斑马鱼所有染色体上，且主要位于3号染色体。对斑马鱼染色体进行归一化处理后，发现22号染色体上的circRNA密度最大。斑马鱼中大多数circRNA均来自蛋白质编码基因位点，仅有3.06%来自长期的非编码RNA基因位点。在成年斑马鱼体内，circRNA分布具有组织特异性，仅有1.31%在血液、心脏、肌肉、脑和鳃中共表达。如circ ttnb1，来源于与编码肌肉蛋白相关的ttnb1基因，除在肌肉中高表达外，而在血液、脑和心脏中表达量较低[29]。Liu等[30]发现多数前体线性RNA只能产生单个circRNA，少数可以产生多达4或5种亚型，如circRNAece2b、circRNAcamk2b1和circRNAnbas等。该结果与先前报道的研究结果相吻合，即单个基因可以通过剪接产生多种执行不同功能的circRNA[31- 32]。此外，Liu等[33]进一步在成年雄性斑马鱼线粒体鉴定得到139个线粒体基因组编码的circRNA，并将由线粒体基因编码的circRN称之为“mecciRNAs”。进一步研究表明mecciRNA和核基因编码的circRNA有着相似的 AG/GT 连接基序，这对于斑马鱼circRNA的研究具有重要的意义。

图1 circRNA的分类及生物学功能

发育过程中的circRNA斑马鱼中的circRNA能通过影响各种生物学过程，进而参与到斑马鱼发育有关的不同途径中。Liu等[30]以junction reads≥5、倍数变化≥2、目标circRNA分子在任意两个样品中共表达、P<0.05为筛选标准，对斑马鱼卵受精后4.5 h(4.5 hours post fertilization，4.5 hpf)、8 hpf、24 hpf、48 hpf和72 hpf 5个不同发育阶段斑马鱼胚胎中差异化表达的circRNA进行测序分析，得到1029个差异化表达的circRNA。研究发现，8 hpf是斑马鱼早期胚胎形成和器官分化最活跃的时期，也是circRNA的最丰富时期。通过GO数据库对斑马鱼发育不同时期差异化表达的circRNA生物学功能进行预测分析，发现大量的功能富集与RNA聚合酶Ⅱ相关，它们可能是通过参与生物转录和翻译过程来调节斑马鱼的生长发育。在斑马鱼发育4.5～8 hpf过程中，circRNA 4、circRNA19、circRNA20、CX43等表达量上调，而circRNA 14、circRNA 15、circRNA 17、MEF2C等表达量下调。功能富集分析发现差异化表达的circRNA主要与细胞形态发生、迁移和分化，碳水化合物衍生物代谢过程以及早期器官发育相关途径。而斑马鱼发育4.5～24 hpf过程中，circRNA7、circRNA19、circRNA20、GATA4、MEF2C等表达量上调，而circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA6、circRNA14等表达量下调，功能富集主要与碳水化合物的生物合成过程、DNA的代谢过程、血管和神经节细胞轴突的发育以及RNA聚合酶Ⅱ参与的转录调控有关。在48 hpf和72 hpf，circRNA7、circRNA8、circRNA9、circRNA20、VMHC、CX43等表达上调，circRNA1、circRNA2、circRNA3、circRNA5、circRNA13、circRNA15等表达下调，功能富集主要与器官的发育调控有关。其中circRNA 20是来源于plastin 3基因，pls3在多个物种间同源，与神经和运动系统发育有关，是运动神经元保持活性的重要因子[34]。在斑马鱼卵受精后的不同发育过程中，circRNA 20表达持续上调，其可能对斑马鱼胚胎运动系统的发育具有重要的调节作用。

在人、小鼠和斑马鱼等不同动物物种之间高度保守的circRNA也得到了一定的研究[35- 36]。如：CDR1as是一种与小脑变性相关蛋白1转录本反义的circRNA[37]，可与神经组织中的miRNA- 7结合。研究表明过表达CDR1as可表现出类似于敲除miRNA- 7的生物学效应，抑制斑马鱼脑部的发育。且CDR1as与miRNA的结合能力比其他已知转录本强10倍，此类小分子可以作为miRNA的拮抗剂，参与基因的转录后调节过程[38- 39]，也表明circRNA可能通过复杂的机制参与器官的形成和发展(图2)。

炎症中的circRNA

由于circRNA的功能与其亲本基因功能相似[40]，故可以通过现有的一些数据库如KEGG、GO，对研究中发现的一些差异化表达的circRNA进行下游的靶标分析和功能富集分析等。此外，归功于内毒素斑马鱼炎症模型的成功建立与成熟应用，炎症中的斑马鱼circRNA也有研究[41- 42]。刘东依[43]对内毒素引起的斑马鱼炎症模型组、PBS空白对照组和配伍组分干预组中差异化表达的circRNA进行分析发现，斑马鱼炎症模型组和PBS空白对照组之间差异化表达的circRNA有43个，其中dre_circ chr12：4631537- 46375145、dre_circ chr8：53519204- 53520037等18个circRNA表达量上调，dre_circ chr22：9417319- 9440114、dre_circ chr10：29431529- 29435905等表达量下调。而斑马鱼炎症模型组和配伍组分干预组之间差异化表达的circRNA有27个，其中dre_circ chr24：37741203- 37767103、和dre_circ chr6：8813630- 8832610等17个circRNA表达量上调，dre_circ chr19：31644209- 31655263、dre_circ chr18：17827911- 17848482等表达量下调，功能富集分析结果显示它们可能参与了细胞凋亡、MAPK等多种信号通路的调控作用，主要涉及碳水化合物跨膜转运、蛋白质-DNA复合物的组装等众多生物学过程进而对内毒素引起的斑马鱼炎症发生的过程产生影响。由此可见斑马鱼中的circRNA是通过极其复杂的机制参与到斑马鱼的炎症发生发展过程中，配伍组分可减少内毒素引起的斑马鱼炎症模型中差异化表达的circRNA数，从多种途径发挥抗炎作用(图2)。

总 结

circRNA具有多种生物学功能，与各种疾病的发生发展过程密切相关。目前研究显示，斑马鱼中的circRNA的数量十分庞大，但斑马鱼的circRNA研究主要集中在发育过程当中，可能是因为斑马鱼生长速度快、幼体时通体透明方便观察等因素利于发育的研究。其次，归功于斑马鱼炎症模型的成功建立及炎症相关转基因斑马鱼品系的产生，炎症反应中的斑马鱼circRNA也得到了初步的研究[44- 45]。但其他疾病中的斑马鱼circRNA仍未得到研究，其一大原因可能是众多疾病并未能在斑马鱼身上建立成熟的模型，这可能是未来斑马鱼及其circRNA的一大研究方向。

图2 斑马鱼中的circRNA