中国家驴MSTN 基因第1 内含子多态性分析

2022-11-17付永智马晓君王茂晗陈芝媛苏咏梅吴建华朱文进

中国畜牧杂志 2022年11期

付永智，马晓君，王茂晗，陈芝媛，赵涵，李哲，苏咏梅，吴建华，朱文进

（河北科技师范学院动物科技学院，河北秦皇岛 066004）

MSTN基因（Myostatin，肌肉生长抑制素）又称GDF-8，属于转化因子β（TGF-β）超家族，作为对动物骨骼肌生长起负调控作用的基因之一，其与多个基因互作，通过终止肌细胞增殖而抑制肌肉生长发育[1-2]。研究表明，MSTN基因的突变是肌肉肥大、增生的重要条件[3]。目前对牛、羊和家禽MSTN基因多态性的研究发现，其与畜禽的生长发育和生产性能有关[4-8]。MSTN基因由3 个外显子和2 个内含子组成，其中外显子序列在不同物种之间属于高保守性[9-10]，但是基因中外显子序列约占10%，大部分为内含子序列。虽然哺乳动物的基因表达普遍不需要内含子，但是内含子中含有具备启动子、增强子和抑制子作用和功能的序列以及多种顺势作用元件，对转录和表达量有重要的调控作用[11-12]。内含子中碱基发生突变可能会引起这些序列功能的改变，影响正常的转录和翻译过程。

本研究对中国14 个品种家驴542 个个体的MSTN基因第1 内含子进行多态性分析，以期从分子水平上了解家驴的遗传多样性，为家驴MSTN基因功能的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 样品来源实验用血样采自14 个品种家驴542 个个体的颈静脉，低温保存带回实验室后，-20℃储存备用。样品信息见表1。

表1 样本信息

1.2 DNA 的提取和PCR 扩增血液中DNA 用苯酚-氯仿法抽提。特异性引物根据马MSTN基因序列（GQ.183900.1）用在线软件Premer Premier 3.0 Plus 设计，引物序列为F：5'-TGCTCCACAATGAATCTCG-3'，R：5'-TGAGACTGAAATCTGCTGCA-3'，预扩增长度为213 bp，由生工生物（上海）股份有限公司合成。

20 μL PCR 扩增体系为：上下游混合引物（10 pmol/μL）1.5 μL、模板DNA（10 ng/μL）1.5 μL、2×EsTaqMaster Mix(dye) 10 μL、ddH2O 7 μL。反应条件为：预变性94℃10 min，变性94 ℃40 s，退火56 ℃40 s，延伸72 ℃40 s，35 个循环，终延伸72℃10 min。

1.3 中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子多态位点检测中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子多态位点检测采用PCR-SSCP 技术，非变性聚丙烯酰胺凝胶浓度为12%，70 mL 凝胶组分为：30% Asr-bis（29:1）28 mL，5×TBE 14 mL，10%过硫酸铵490 μL，TEMED 50 μL，ddH2O 补至70 mL。电泳条件为：180V 恒压18 h。电泳结束后进行银染，将不同带型样品的PCR 产物送往生工生物（上海）股份有限公司北京测序部测序。

1.4 中国14 个品种家驴MSTN基因第一内含子遗传多样性分析基因型鉴定结果用Excel 表格整理，并计算基因频率、基因型频率和多态信息含量（PIC）。用SPSS 软件检验Hardy-Weinberg 平衡状态。

2 结果与分析

2.1 中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子PCR 扩增结果MSTN基因第1 内含子PCR 扩增产物1.6%琼脂糖凝胶电泳结果见图1。可见，扩增片段长约213 bp，大小符合预期，且条带特异性良好，可直接进行测序或后续实验。

图1 MSTN 基因第1 内含子PCR 产物电泳图

2.2 中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子PCRSSCP 分析对中国14 个品种家驴542 个个体的MSTN基因第1 内含子PCR 扩增产物进行SSCP 分析，其分型结果和测序结果见图2 和图3。

由图2 和图3 可见，中国家驴MSTN基因第1 内含子存在多态性，SSCP 结果显示3 种带型，对不同带型的PCR 产物进行测序，结果与参考序列比对发现，基因1 323 位点碱基发生T→C 突变，由此产生TT、TC 和CC 3 种基因型。

图2 MSTN 基因第1 内含子PCR-SSCP 分析结果图

图3 MSTN 基因第1 内含子扩增片段测序峰值图

2.3 中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子不同基因型频率和基因频率分析由表2 可见，14 个品种家驴的基因型频率分布不同，其中，大型德州驴CC 基因型频率最高（0.53），小型太行驴TC 基因型频率最高（0.62），大型渤海驴TT 基因型频率最高。14 个品种家驴T 等位基因频率的分布（0.62～0.80）高于C 等位基因频率的分布（0.20～0.38），该突变位点产生的基因和基因型频率在品种间的分布没有明显规律。

表2 中国14 个品种家驴MSTN 基因第1 内含子突变位点（g.1323 T＞C）基因频率和基因型频率分析

2.4 中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子遗传多样性分析中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子多态性位点g.1323T→C 的多态信息含量和Hardy-Weinberg 平衡检验结果见表3。

表3 多态信息含量计算和Hardy-Weinberg 平衡检验

由表3 可知，14 个品种家驴遗传多态性均为中度多态，其中太行驴多态信息含量最高，为0.360 0；渤海驴最低，为0.271 8。渤海驴的多态信息含量较低，可能是由于渤海驴采样是在相邻的村镇，有相同公驴的后代。

Hardy-Weinberg 平衡检验结果显示，晋南驴处于极度不平衡状态（P＜0.01），广灵驴和庆阳驴处于不平衡状态（P＜0.05），其余11 个品种处于平衡状态（P＞0.05），说明晋南驴、广灵驴和庆阳驴可能在采样或样本量存在问题或在该位点存在随机遗传漂变。

3 讨论

家畜MSTN基因第1 内含子多态性丰富。刘晓琴等[13]对6 个品种猪MSTN基因多态位点进行筛选，发现第1 内含子存在5 个突变位点（g.1735G→A、g.2099C→T、g.2882T→C、g.2970C→T 和g.3013A→G）。岳续朋等[14]研究发现，西门塔尔牛和夏洛莱牛MSTN基因第1内含子819～1127bp区域存在AA、BB、CC、AB、BC 和AD 6 种基因型。国内外学者通过不同的方法在马MSTN基因第1 内含子检测到5 个突变位点（g.1485C→T、g.1634T→G、g.2024G→A、g.2115A→G和g.2327A→C）[15-18]。其中g.2115A→G 突变位点被发现与焉耆马、伊犁马的胸围、体长显著相关[19]；Hill[20]和Tozaki[21]等发现该位点与纯种马短跑能力和体高有显著关联，并将其作为预测比赛能力和骨骼肌指标的标记。家驴与马为同属动物，根据MSTN基因高保守性推测，家驴MSTN基因第1 内含子也可能存在影响家驴性状的突变位点。然而，关于家驴MSTN基因第1 内含子多态性的研究报道较少，只有Liu 等[19]通过PCR-RFLP 方法在中国13 个品种家驴328 个个体中检测到2 个突变位点，分别为g.2014G →A 和g.2395C →G，且基因型分别为GG 和CC 型占比最高，g.2014G →A 位点处于Hardy-Weinberg 平衡状态，g.2395C →G 位点处于不平衡状态。本研究采用PCRSSCP 方法在中国14 个品种家驴MSTN基因第1 内含子中检测到另一个突变位点（g.1323T →C），该位点在不同品种或类型之间的基因型分布没有明显规律，且遗传多样性丰富，除了晋南驴、广灵驴和庆阳驴群体外，其他品种群体均处于Hardy-Weinberg 平衡状态。但Liu等[22]和本研究都没有将检测到的MSTN基因第1 内含子突变位点与家驴相关性状进行关联分析，这些突变位点是否与同属的动物马一样，存在与驴体尺或其他性状相关有待进一步研究。