HMGB1对呼吸道合胞病毒毛细支气管炎患儿单核细胞免疫功能的影响*

应 春，沈彩燕，詹建华，郭利琴，吴慧芬，李鹏飞

（浙江中医药大学附属江南医院萧山区中医院，浙江杭州 311201）

毛细支气管炎常见于1 至6 个月的婴幼儿，是儿童常见的急性下呼吸道感染性疾病，其特征性病变部位为肺细支气管。该病临床症状主要表现为为喘息、气短和三凹征，其常发生在冬季，最常见病原体为呼吸道合胞病毒［1］。现有研究表明，呼吸道合胞病毒（respiratory syncytial virus，RSV）毛细支气管炎是婴幼儿毛细支气管炎发展为支气管哮喘的高危因素之一［2］。流行病学研究表明呼吸道合胞病毒毛细支气管炎与儿童期反复发作喘息和哮喘具有相关性，呼吸道合胞病毒可以从母体垂直传播到胎儿的肺和呼吸道，婴儿出生后病毒持续感染与气道高反应性也具有显著相关性［3-4］。但在目前的临床研究中，婴幼儿呼吸道合胞病毒毛细支气管炎仍然缺乏可靠的生物标志物、有效的疫苗和治疗策略。

高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）是一种高度敏感的核DNA 结合蛋白，主要存在于细胞核内，具有参与核小体稳定、细胞分化和DNA 修复等功能［5］，HMGB1 是在炎症中启动先天性和适应性免疫反应的关键介质分子［6］。Zhou等［7］研究观察HMGB1 在小鼠RSV 感染和慢性气道功能障碍的疾病发生发展中发挥重要作用，同时该项研究认为HMGB1 在RSV 感染相关呼吸道疾病中可作为一种生物标志物。然而，关于HMGB1在临床RSV 毛细支气管炎的表达及其在疾病发展过程中激活免疫细胞作用的研究报道仍然很少。因此，本研究对相关临床标本和体外细胞中HMGB1 的表达进行了探讨，并探讨了HMGB1 对单核细胞功能的影响，旨在提供RSV 毛细支气管炎诊断和治疗的参考资料。

材料和方法

1 临床资料

选取于2018 年1 月至2020 年1 月期间儿科住院治疗并给予精细化护理的确诊为RSV 毛细支气管炎的30例患儿作为研究（research）组，选取同期于我院进行体检的30 例健康足月婴幼儿作为对照（control）组。研究获得患者知情同意并通过伦理委员会审批。两组基本资料经比较无显著性差异（P＞0.05），具有可比性，见表1。纳入标准：（1）患儿年龄在2 岁以下且患病时间少于3 d；（2）入院后检测到血清特异性RSV 特异性IgM 为阳性；（3）符合《毛细支气管炎诊断、治疗与预防专家共识（2014 年版）》诊断标准［8］；（4）均为首次诊断为RSV 毛细支气管炎。排除标准：（1）有哮喘相关疾病家族史的；（2）具有先天性心脏病和肺功能不全的；（3）疑似免疫缺陷和过敏性疾病的儿童；（4）治疗前4 周内服用过抗病毒药物的。研究组的所有患者均接受了为期12 个月的门诊随访，以评估儿童是否有胸闷、干咳、喘息、呼气困难及支气管扩张等症状。

表1 基线数据的比较Table 1.Comparison of baseline data

2 主要方法

2.1 外周血采集及检测 两组婴幼儿入院时均采集2 mL 外周静脉血置于EDTA 管内，并将其置于4°C保存，离心，分离上清液，采用自动生化分析仪进行常规血细胞分析和C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）水平检测。外周血血浆HMGB1 水平检测采用ELISA 法，检测步骤严格按照HMGB1 试剂盒（上海臻科生物科技有限公司）说明操作。

2.2 细胞培养 人支气管上皮细胞16HBE（上海中乔新舟生物科技有限公司）采用角质形成细胞完全培养液培养，单核细胞THP-1 细胞系（上海中乔新舟生物科技有限公司）使用90% 1640 培养基（Corning）、10% FBS、100 U/L 青霉素和100 mg/L 链霉素（上海碧云天生物技术有限公司）进行培养，细胞均在5% CO2的恒温培养箱中培养，温度为37 ℃，当细胞密度至90%时进行下一步实验。

2.3 RSV 病毒转染及共培养 使用前，人重组RSVA2 菌株（ATCC）经5 000×g连续离心10 min 进行纯化，-80 ℃分装保存。在RSV 病毒转染前6 h 用碱性培养液替换16HBE 细胞培养液，当细胞密度达到90%时，根据感染，感染倍数（multiplicity of infection，MOI）=1.0，未感染的16HBE 细胞采用与感染组相同量的30%蔗糖溶液进行处理。细胞培养上清液和提取的蛋白质均储存在-80 ℃保存，待后续检测。转染RSV 组和转染对照组的细胞在传代后生长到30%～50%时，将细胞分为HMGB1 抑制组和观察组，观察组细胞培养液中加入DMSO，HMGB1抑制组在RSVA2 转染的16HBE 细胞培养液中加入0.16µmol/L甘草酸（glycyrrhizin），直到细胞生长到适当的浓度。采用Transwell 板（Corning）进行THP-1细胞系和16HBE 细胞系的共培养，THP-1 细胞接种密度为1×109/L，按5 mL 每孔加入Transwell 下孔，上孔分别加入RSV 病毒转染的1×106HMGB1 抑制组16HBE细胞和观察组16HBE 细胞，两组细胞共培养48 h 后提取下细胞层总蛋白待测。

2.4 RT-qPCR 采用RNeasy Mini Kit（凯杰生物工程有限公司）提取RSVA2 转染的16HBE 细胞和非转染的细胞mRNA，提取后采用NanoDrop 仪器（Thermo）进行定量，按照试剂盒说明书进行逆转录。正向和反向引物序列为5'-ACTGCAATCAYACAAGATGCAACRA-3' 和5'-CAGATTGRAGAAGCTGATTCCA-3'。以β-actin 为内参照，根据2-ΔΔCt方法来计算基因的相对表达量。

2.5 Western blot 收集细胞，加入RIPA 裂解液（北京索莱宝科技有限公司）和终浓度为1 mmol/L 的蛋白酶抑制剂PMSF（北京索莱宝科技有限公司）进行超声裂解，提取蛋白。采用BCA法定量蛋白浓度后，用8%SDS-PAGE 分离蛋白。电泳结束后，用半湿转移法将蛋白转移到PVDF 膜上，用5%脱脂牛奶封闭1 h，加入TLR-4（1∶2 000）、TLR-7（1∶500）和GAPDH（1∶5 000）的Ⅰ抗稀释液，4 °C 下孵育过夜，然后用0.1% PBST 洗涤3 次，加入相应的HRP 标记的山羊抗兔（小鼠）Ⅱ抗（1∶3 000）、室温孵育1 h，然后用0.1%的PBST 洗涤3 次。最后加入ECL 化学发光溶液，曝光。采用ImageJ软件进行图像分析。

3 统计学处理

所有数据均采用SPSS 23.0软件进行统计分析。ELISA 和RT-qPCR 实验检测结果用均值±标准差（mean±SD）表示，组间两两比较使用独立样本的t检验。免疫组化方法分析HMGB1的数量和表达，其相关性采用Person 相关分析。不同治疗组之间的细胞数比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

结果

1 婴幼儿外周血血浆HMGB1的表达水平比较

与健康对照组比较，RSV 毛细支气管炎患儿外周血中HMGB1的表达水平显著升高（P＜0.01），见图1A。且外周血单核细胞数量、外周淋巴细胞数量及CRP 水平与RSV 毛细支气管炎患儿外周血中HMGB1表达水平成正相关性（P＜0.05），其中外周血单核细胞数量与外周血中HMGB1 表达水平相关性最显著，见图1B～1D。

2 RSV转染细胞中HMGB1的表达

通过qRT-PCR 检测确定细胞经过RSVA2 病毒转染（图2A），相较对照组，经病毒转染后的16HBE细胞培养液中HMGB1的表达显著增加（P＜0.01），提示16HBE 细胞经RSVA2 转染后HMGB1 的表达可上调，而加入甘草酸可显著下调HMGB1 的表达（P＜0.01），见图2B。

3 单核细胞中Toll样受体的表达水平

RSVA2 转染的16HBE 细胞、感染对照组细胞、HMGB1 抑制组细胞分别与单核细胞THP-1 进行共培养后，经Western blot 检测单核细胞中TLR-4 和TLR-7 蛋白的表达水平，结果显示与RSVA2 转染的16HBE细胞共培养后，THP-1细胞中TLR-4的表达水平显著增加（P＜0.01），而TLR-7 水平无显著变化；通过在细胞培养液中添加甘草酸抑制RSVA2 转染的16HBE 细胞HMGB1 表达可以显著抑制共培养的THP-1细胞中TLR-4的表达（P＜0.01），见图3。

讨 论

婴幼儿的毛细支气管炎也被称为哮喘性肺炎，伴有急性RSV 感染的毛细支气管炎可能会伴有继发性细菌感染和呼吸衰竭，则需要进行机械通气治疗且在治疗过程中需进行精细化的护理。因RSV 感染引起的严重呼吸道疾病和死亡率较高，是全球5 岁以下儿童死亡的一个重要原因［9］，有研究观察到在RSV 感染的活跃阶段的标志物和相关靶点关系密切。HMGB1 主要存在于细胞核中，当细胞受到“危险信号”的刺激时，HMGB1 作为警报素蛋白家族分子，其可以被快速激活并释放到细胞外部，直接作为启动炎症细胞因子和维持由感染性或非感染性疾病引起的免疫反应，并维持受损组织内的稳态平衡［10］。HMGB1 通过影响免疫细胞不仅可以参与多种细胞因子和趋化促炎细胞引起的炎症反应，而且还参与了哮喘的气道致敏和诱导［11］，直接影响气道炎症。有研究认为HMGB1 可以作为反映气道炎症的一种生物标志物［12］。但目前临床研究对HMGB1 在合胞病毒感染肺炎中研究较少的同时其作用机制亦鲜有研究，因此本文选取合胞病毒肺炎的患儿外周血研究呼吸道合胞病毒支气管患者体内HMGB1 水平的表达及机制。

Figure 1.Expression level and correlation analysis of HMGB1 in peripheral blood plasma of infants and young children.A：comparison of the levels of HMGB1 in peripheral blood between the two groups；B：the correlation between the number of monocytes and the level of HMGB1；C：the correlation between the number of monocytes in peripheral blood and the level of HMGB1；D：the correlation between the level of CRP in peripheral blood and the level of HMGB1.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs control group.图1 婴幼儿外周血血浆HMGB1的表达水平及相关性分析

Figure 2.Related mRNA levels and HMGB1 expression in RSVA2-transfected 16HBE cells.A：RT-qPCR detection of RSVA2 infection status；B：the level of HMGB1 in cell supernatant.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs β-actin group；##P＜0.01 vs control group；&&P＜0.01 vs RSVA2 group.图2 RSVA2转染的16HBE细胞中相关mRNA水平及HMGB1的表达

Figure 3.Expression levels of Toll-like receptors in THP-1 cells.The TLR-4 and TLR-7 protein expression levels in monocytes were detected by Western blot.Mean±SD. n=30.**P＜0.01 vs control group；##P＜0.01 vs RSVA2 group.图3 单核细胞中Toll样受体的表达水平

本研究收集了RSV 毛细支气管炎儿童和健康儿童的血浆样本，结果显示RSV 毛细支气管炎患儿血浆HMGB1水平显著增加，这与之前报道中RSV 毛细支气管炎动物模型中的结果一致［13］。RSV 毛细支气管炎患儿外周血中HMGB1 表达水平与外周血单核细胞数量、外周淋巴细胞数量及CRP 水平与成正相关，其中外周血单核细胞数量与外周血中HMGB1表达水平相关性最显著，说明因RSV 感染引起的毛细支气管炎患儿机体中存在炎症反应增加，由于受到本院资源条件的限制，纳入研究病例数较少，因此对于HMGB1 在临床上RSV 感染毛细支气管炎的表达水平和预后研究仍有待通过更大的数据和高质量的临床对照实验来验证。有学者对HMGB1 与肺部炎症发展的关系进行相关研究，结果观察有密切相关性，为本研究提供依据［12］。本研究基于人支气管上皮细胞16HBE 建立RSV 感染细胞系，并检测细胞上清中HMGB1 水平，同时将RSV 感染的16HBE 细胞系与单核细胞THP-1 细胞系共培养以检测单核细胞中TLR-4 和TLR-7 蛋白的表达水平，进而探讨RSV感染、HMGB1 水平与单核细胞中免疫调节作用。结果显示，经病毒转染后的16HBE 细胞培养液中HMGB1的表达显著增加，说明16HBE细胞经RSV转染后可上调HMGB1的表达，提示该模型可以模拟感染RSV 的人支气管上皮细胞。共培养结果显示结果显示THP-1 细胞中TLR-4 的表达水平显著增加，而TLR-7水平无显著变化，通过在细胞培养液中添加甘草酸可以显著抑制THP-1 细胞中TLR-4 的表达，以抑制RSV 转染的细胞HMGB1 水平，这一结果提示，RSV 在感染16HBE 细胞后可以通过HMGB1 激活单核细胞相关的免疫功能。Hou 等［14］报道了RSV 感染小鼠肺组织中HMGB1 水平的升高。有研究对纯化的HMGB1 与人气道上皮细胞系和外周血单核细胞及从外周血单核细胞中分离和诱导的各种免疫细胞进行共培养［15］，其结果显示，HMGB1 治疗可显著增加人气道上皮细胞系中NF-κB 和P38 MAPK 的磷酸化。在免疫细胞中添加HMGB1 可以同时促进细胞因子/趋化因子释放，并激活NF-κB 和P38 MAPK 通路。这些结果表明，HGMB1 可促进免疫细胞分泌的促炎介质及其介导的炎症反应，参与RSV 的发病机制。TLR-4 是近年来观察到存在于先天性免疫系统中的识别受体，TLR-4参与呼吸系统疾病的发生。有研究提示，TLR-4 参与RSV 感染后的支气管上皮细胞凋亡，敲低其表达后可以减少支气管上皮细胞凋亡［15］。本研究结果显示感染RSV 的16HBE 细胞可以显著激活单核细胞中的TLR-4 信号通路，从而诱导体内先天免疫系统激活，本研究还观察到HMGB1可以通过激活单核细胞中的TLR-4 来介导一系列下游的细胞因子/趋化因子级联，因此，阻断HMGB1 的促炎功能可能是开发新的治疗方法的有效途径。

本研究浅层分析了HMGB1 的表达水平与儿童呼吸道合胞病毒毛细支气管炎的发展的关系当仍存在许多不足：（1）本研究以患儿的外周血为基点对HMGB1、TLR-4 和TLR-7 的表达进行观察，但是炎症反应和患儿机体免疫对抗时一系列的反应过程，单论TLR-4 和TLR-7 的分泌状况具有一定局限性。（2）本次研究仅在外周血层面讨论HMGB1、TLR-4 和TLR-7 蛋白的表达水平与儿童呼吸道合胞病毒毛细支气管炎的关系缺乏动物实验的验证，临床研究还需通过动物模型深入探讨以验证结论。

综上所述，HMGB1 的表达水平与儿童呼吸道合胞病毒毛细支气管炎的发展有关，HMGB1 在单核细胞介导的炎症过程中起着重要作用。