FPR2通过ERK1/2信号通路调控炎症状态下滋养细胞生物学功能*

李淑贤，周美娟，李安娜，房振亚，郭君君，张美华

（山东省妇幼保健院国家卫健委生育调控技术重点实验室，济南山东 250014）

绒毛膜羊膜炎（chorioamnionitis，CAM）是常见的宫内感染性疾病，可导致产妇发生子宫内膜炎、子宫腔内粘连和盆腔脓肿，引发死胎、早产、新生儿感染和败血病等，影响胎儿生长发育，引起多种新生儿疾病［1-2］，是目前产科和儿科专家共同关注的焦点，探究其分子机制，寻找有效的治疗新靶点，对于临床诊疗具有重要意义。

甲酰肽受体2（formyl peptide receptor 2，FPR2）属于G 蛋白偶联受体家族成员，参与炎症、神经退行性疾病、肿瘤和糖脂代谢紊乱等相关疾病的多种生理和病理过程［3-4］。研究表明，FPR2激活可促进炎症反应，增加单核细胞趋化性和中性粒细胞招募［5］；Fpr2基因缺陷的小鼠通过减少炎症反应和减轻心肌功能障碍来缓解脓毒症［6］。另一方面，FPR2 也可与多种抗炎介质结合产生抗炎作用［7-8］。因此，FPR2是参与多种炎性疾病的细胞膜受体，是这些疾病的潜在诊治靶点。丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）是细胞内的一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，参与细胞生长、发育、增殖、死亡以及细胞间多种生化反应信号的识别、传递及放大等处理过程［9］，包含3 个主要通路：细胞外信号调节激酶1/2（extracellular signal-regulated kinase 1/2，ERK1/2）、c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）和p38 MAPK 信号通路［10］。研究显示MAPK 信号通路可作为FPR2的下游调控信号通路，如在早期脑损伤的研究中，FPR2 通过MAPK 信号通路调控小胶质细胞的炎症反应［11］，而且FPR2基因敲除可通过MAPK信号通路减轻由脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）诱导的肺部炎症反应［12］。但FPR2 能否通过MAPK 信号通路调控滋养细胞炎症反应并参与CAM 的发生发展，目前尚不清楚。

本研究通过收集CAM患者胎盘组织，明确FPR2在其中的表达和定位；并利用LPS 建立滋养细胞系HTR-8/SVneo 体外炎症模型，同时利用小干扰RNA敲减FPR2基因表达，探究炎症条件下FPR2 对滋养细胞炎症因子释放及细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响，并探究其作用的信号通路，揭示FPR2 对滋养细胞生物学功能的调控作用和机制，以期为CAM 的治疗提供参考资料。

材料和方法

1 胎盘样本

收集2020 年1 月～2021 年1 月在山东省妇幼保健院诊疗的10 例CAM 患者和10 例正常产妇胎盘组织。所有患者均签署知情同意书，临床样本采集过程经山东省妇幼保健院医学伦理委员会审核通过。胎盘剥离后分别于胎儿面及母体面各切取1 cm×1 cm×1 cm 大小的组织，立即置于预冷的PBS 中。PBS冲洗后置于做好标记的冻存管中，液氮速冻后置于-80 ℃保存。另取相同大小组织，预冷PBS漂洗后置于4%多聚甲醛中固定，用于后续组织切片的制作。

2 细胞

人绒毛膜滋养层细胞系HTR-8/SVneo 购自ATCC。

3 主要试剂和仪器

RPMI-1640 培养液、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、减血清培养液OPTI-MEM 和转染试剂Lipofectamine 2000购自Gibco；细菌LPS、丙酮酸钠、青-链霉素混合液和FPR2小干扰RNA（siFPR2）购于Sigma；FPR2 抗体（ab63022）购自Abcam；ERK1/2 抗体（11257-1-AP）、p-ERK1/2 抗体（28733-1-AP）、p38抗体（14064-1-AP）和p-p38 抗体（28796-1-AP）购于Proteintech；JNK 抗 体（sc-7345）和p-JNK 抗体（sc-6254）购于Santa Cruz；β-actin 抗体（GB11001）和辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗IgG（G1213）购自武汉赛维尔生物科技有限公司；ELISA 试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司；EdU 细胞增殖检测试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司；annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒、基质胶和0.25%胰酶购自BD；划痕插件购自ibidi；Transwell小室购自Corning；BCA 蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司。

4 主要方法

4.1 细胞培养 HTR-8/SVneo 细胞在含10% FBS、1%丙酮酸钠和1%青-链霉素混合液（包括1×105U/L青霉素和100 mg/L 链霉素）的RPMI-1640 培养液中，于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养，每2～3 d 换液1 次。待细胞密度达80%～90%时，用0.25%胰酶消化，进行传代培养做后续实验。

4.2 细胞转染 方法如前所述［13］。HTR-8/SVneo细胞以每孔2×105个的密度接种于6孔板中，培养过夜，将培养液换成减血清培养液OPTI-MEM。取100µL OPTI-MEM 于EP 管中，加入4 µL Lipofectamine 2000和1 200 ng siFPR2（6µL），混匀，室温孵育15 min 后轻柔、均匀加入到每孔中。培养8 h 后，换成完全培养液，继续培养至48 h，收集细胞进行后续实验。

4.3 细胞分组 取对数生长期HTR-8/SVneo 细胞，以每孔2×105个的密度接种至6 孔板中，置于培养箱中培养，待细胞密度达60%时按以下分组进行处理：（1）正常对照（control，CON）组：HTR-8/SVneo细胞以完全培养液培养12 h；（2）LPS 组：培养液中加入100µg/L LPS，培养12 h；（3）LPS+siFPPR2 组：取siFPR2转染后的HTR-8/SVneo 细胞，待细胞密度达60%时，加入100µg/L LPS，培养12 h。

4.4 Western blot实验 提取组织蛋白：取黄豆大小胎盘组织于预冷的研钵中，加入液氮，研磨至粉末状，加入500µL 含1%PMSF 的RIPA，置于冰上反应30 min，4 ℃、12 000×g离心30 min，上清液转移至EP管中。提取细胞蛋白：用预冷的PBS 轻柔洗涤孔板中的细胞，加入100µL 含1% PMSF 的RIPA，置于冰上反应30 min，4 ℃、12 000×g离心30 min，上清液转移至EP 管中。提取的组织蛋白和细胞蛋白用BCA试剂盒检测蛋白含量。取适量蛋白，加入适量上样缓冲液，煮沸5 min使蛋白变性，进行SDS-PAGE。电泳结束后，将分离的蛋白转移至PVDF膜，5%脱脂牛奶室温下封闭1 h；分别加入FPR2、ERK1/2、p-ERK1/2、p38、p-p38、JNK、p-JNK 和β-actin 抗体，4 ℃孵育过夜；TBST 洗膜3 次，每次10 min，加入辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗IgG，室温孵育1 h，TBST 洗膜3次后加入增强化学发光试剂避光显影，凝胶成像分析仪采集图片，ImageJ 软件分析蛋白条带灰度值，以目标蛋白与内参照β-actin比值作为各蛋白相对含量。实验重复3次。

4.5 免疫组织化学染色 方法如前所述［14］。胎盘组织石蜡包埋切片后，室温放置30 min，回温后60 ℃烘烤30 min，放入二甲苯中10 min，之后依次放入100%、95%、90%、80%、70%和50%乙醇中各5 min，最后置于PBS；将切片置于0.01 mol/L 的柠檬酸盐缓冲液中，加热至沸腾，保持10 min 进行抗原修复；待玻片自行冷却后加入0.3% Triton X-100 作用20 min；PBS 冲洗后标本上加入3% H2O2，孵育10 min，随后加入山羊血清室温封闭60 min，滴加Ⅰ抗4 ℃封闭过夜。PBS 清洗3 次后加入Ⅱ抗室温孵育1 h，滴加苏木素复染5 min，流水冲洗，盐酸乙醇分化10 s后继续流水冲洗5 min，切片依次置于70%、80%和90%酒精中各3 min，95%乙醇5 min，100%乙醇10 min，二甲苯20 min；最后中性树胶封片，晾干后显微镜下观察拍照。

4.6 ELISA 各组细胞按条件处理后，吸取上清于EP管中，用ELISA试剂盒检测白细胞介素6（interleukin-6，IL-6）、IL-8 和肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）含量。按说明书要求配制标准品，将标准品、样品稀释液和样品各100µL 加入到酶标板孔中，加上封板膜，37 ℃反应90 min。吸除酶标板内液体，每孔加入抗体工作液100 µL，37 ℃反应60 min。1×洗涤缓冲液洗涤3 次，每次浸泡1 min 左右。将准备好的ABC 工作液按每孔100 µL 加入酶标板中，反应30 min。1×洗涤缓冲液洗涤5 次，每次浸泡1～2 分钟。每孔加入90 mL TMB 显色液，37 ℃避光反应15～20 min。用酶标仪在450 nm测定A值。

4.7 EdU 细胞增殖活性检测实验 接种各组细胞于96 孔板中，每孔5 000 个细胞。按说明书要求在100 µL 培养液中加入100 µL 2× EdU 工作液，37 ℃孵育2 h；去除培养液，每孔加入200µL 4%多聚甲醛固定液，室温固定15 min；去除固定液，每孔用200µL PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min；每孔加入200 µL通透液，室温孵育15 min，去除通透液，每孔用200µL PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min；每孔加入0.5 mL Click 反应液，室温避光孵育20 min，去除反应液，PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min；加入Hoechest 进行细胞核染色，避光孵育15 min 后PBS 洗涤细胞3 次，每次3 min，将96孔板置于高内涵分析仪中拍照，计数。用ImageJ软件进行数据分析。

4.8 流式细胞术检测细胞凋亡情况 收集不同组的HTR-8/SVneo 细胞，PBS 轻柔洗涤2 遍，1 500×g离心5 min，弃除上清液，加入100µL上样缓冲液，吹打悬浮细胞，按说明书要求加入5 µL annexin V-FITC和5µL PI，混合均匀；室温避光孵育15 min 后，再加入400µL 上样缓冲液，置于冰上，1 h 内置于流式细胞仪中检测。实验重复3次。

4.9 划痕实验 方法如前所述［15］。将ibidi 划痕插件置于6孔板中，按每孔6×104个细胞密度接种HTR-8/SVneo 细胞，培养过夜后用镊子小心揭除插件，用PBS 轻柔冲洗细胞碎片，孔板内注入无血清培养液，培养24 h 后置于显微镜下观察划痕，并通过ImageJ软件进行分析。

4.10 Transwell 实验 方法如前所述［16］。将50 µL 1 g/L 基质胶加至上层小室中，37 ℃放置1 h 后，上层小室中接种200µL无血清培养液悬浮的细胞1×105，下室加入600µL 含10%血清的完全培养液，37 ℃培养24 h。用镊子小心夹取上层小室，吸除小室中培养液，小室在PBS 中轻柔洗涤2 次，用棉签小心擦拭小室内侧底部，将小室放回板内，加入1 mL 4%多聚甲醛固定小室下层细胞20 min，PBS 轻柔洗涤2 次，加入0.1%结晶紫稀释液，染色20 min，PBS 轻柔洗涤2 次后，将小室置于正置显微镜下，观察小室底部细胞并拍照。

5 统计学处理

采用GraphPad Prism 8.0 软件进行统计学分析。所有实验均进行了至少3 次重复。计量资料经正态性检验符合正态分布，以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间均数比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。图片数据的采集和处理用ImageJ软件进行。

结果

1 CAM患者胎盘组织中FPR2表达情况

免疫组化结果显示，FPR2在CAM患者胎盘组织中的表达量明显高于正常产妇，且主要表达于滋养细胞层中，见图1A。Western blot 检测结果同样显示，CAM 患者胎盘组织中FPR2 表达量显著增加（P＜0.01），见图1B。利用LPS（100 µg/L）处理HTR-8/SVneo滋养细胞构建体外细胞炎症模型，结果显示自LPS 处理4 h 开始FPR2 表达量随时间不断增加，处理12 h 时，FPR2 表达量显著增加（P＜0.01），见图1C。因此后续实验选取12 h 作为LPS 刺激HTR-8/SVneo细胞的作用时间。

2 敲减FPR2 可减少LPS 诱导的HTR-8/SVneo 细胞促炎因子的分泌

利用小干扰RNA 敲减HTR-8/SVneo 细胞中FPR2基因，Western blot 实验结果显示FPR2 蛋白表达显著减少（P＜0.01），见图2A。LPS 刺激HTR-8/SVneo 滋养细胞12 h 后，ELISA 检测结果显示培养液上清中促炎因子IL-6、IL-1β 和TNF-α 表达水平显著升高（P＜0.01）；将LPS 作用于FPR2敲减的HTR-8/SVneo 滋养细胞，结果显示促炎因子TNF-α、IL-1β 和IL-6 表达水平均较LPS 组显著下降（P＜0.05 或P＜0.01），见图2B。

3 敲减FPR2 可减轻LPS 诱导的HTR-8/SVneo 细胞功能损伤

利用EdU 实验检测细胞增殖活性，结果显示与正常组相比，LPS处理组中HTR-8/SVneo细胞增殖活性显著降低，细胞增值率由之前的80%左右降至50%左右（P＜0.01），但FPR2敲减后，细胞增殖率增加至70%左右（P＜0.05，图3A、3B）。流式细胞仪检测细胞凋亡结果显示，对照组细胞凋亡率约为8%，LPS 处理后，HTR-8/SVneo 细胞凋亡率增至25%左右（P＜0.01），当FPR2敲减后凋亡率减少到12%左右（P＜0.01，图3C、3D）。Transwell 实验结果显示，LPS处理组穿透至小室底部的细胞数目显著降低，表明LPS 可显著抑制HTR-8/SVneo 细胞侵袭能力（P＜0.01），但FPR2敲减后，侵袭至小室底面细胞数目显著增加（P＜0.01，图3E、3F）。划痕实验结果显示，LPS 处理24 h 后HTR-8/SVneo 细胞迁移能力较正常对照组显著减弱，迁移面积约为正常组的20%（P＜0.01）；FPR2敲减后，迁移面积显著增加（P＜0.01，图3G、3H）。

4 FPR2 通过ERK1/2 信号通路调控炎症状态下滋养细胞功能

提取CON 组、LPS 组T LPS+siFPR2 组细胞的总蛋白，利用Western blot检测细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、JNK、p-JNK、p38 和p-p38 的蛋白表达水平（图4A、4B），结果显示ERK、JNK 和p38 表达无显著差异，但LPS 组p-ERK1/2、p-JNK 和p-p38 蛋白表达均显著增高（P＜0.05，P＜0.01），FPR2基因敲减后，p-JNK 和pp38蛋白表达与LPS处理组无显著差异，但p-ERK 蛋白表达下降显著（P＜0.01，图4A、4B）。

讨 论

CAM是由于胎盘组织受到病原菌入侵后引起的感染性炎症，是早产的常见原因，可能导致多种不良妊娠结局，如胎儿生长受限、早产、新生儿感染和败血症等，因此临床上常用抗炎药物进行治疗［17-18］。滋养细胞是构成母胎界面的关键细胞，其重要作用贯穿妊娠过程的始终。越来越多的证据显示，妊娠过程中的炎症感染会造成滋养细胞功能损伤、侵袭缺陷、子宫螺旋动脉重塑障碍，进而引发胎盘血管网络生长构建不良，胎盘缺血、缺氧、过度氧化应激及代谢功能紊乱等病理改变，最终导致多种不良妊娠结局的发生［19-20］。这些研究提示CAM 可能与炎症状态下滋养细胞生物学功能受损有关，但具体作用机制尚不明确。

Figure 1.The expression of FPR2 increased in the placenta of chorioamnionitis（CAM）patients.A：the expression and location of FPR2 in the placenta tissues derived from CT（n=10）and CAM（n=10）patients were analyzed by IHC（scale bar=50µm）；B：the expression of FPR2 in the placenta tissues derived from CT and CAM patients was analyzed by Western blot（n=3）；C：Western blot was used to detect the protein levels of FPR2 in HTR-8/SVneo cells treated with 100µg/L LPS for different time（0，2，4，8，12，24 and 48 h）.Mean±SD.△△P＜0.01 vs CT group；**P＜0.01 vs 0 h group.图1 FPR2在CAM患者胎盘组织中高表达

FPR2 属于甲酰肽受体家族成员，是一种G 蛋白偶联受体（人的为FPR2，小鼠为Fpr2）。FPR2 被证实参与多种炎症引发的疾病的发生和发展，如心肌炎、风湿性关节炎、肺炎、结肠炎等［21-23］，FPR2通过结合配体参与人体的炎症反应，而且根据结合配体的不同，表现出促炎或抑炎两种截然相反的功能。当FPR2 与脂氧素A4（lipoxin A4，LXA4）、消退素D1（resolvin D1，RvD1）、糖皮质激素调节蛋白A 等抗炎介质结合时，可抑制炎症反应［24-25］；另一方面，FPR2又可以通过增加单核细胞和中性粒细胞的趋化和募集，介导巨噬细胞M1 极化，加速炎症反应［26］。在肺组织的炎症模型中，FPR2基因敲除显著降低了LPS诱导炎症反应，降低促炎因子的表达［12］。研究显示，人类胎盘组织中表达FPR2，且在子痫前期、胎儿生长受限、妊娠期糖尿病患者胎盘中表达出现异常［27，28］，在妊娠期糖尿病中，FPR2 表达显著升高，且FPR2敲减后会逆转高糖对滋养细胞功能损伤［29］。在胎儿生长受限母体胎盘中FPR2表达显著升高，且FPR2 可影响滋养细胞分化和内皮细胞功能导致胎盘功能不全［30］。这些研究结果表明FPR2 对于胎盘滋养细胞的功能至关重要，但是在胎盘炎症相关疾病中，FPR2研究较少，尤其在CAM中更是鲜有研究。课题组前期研究发现RvD1 可以与FPR2 结合减轻LPS 导致的滋养细胞的炎症反应，但FPR2 对于滋养细胞生物学功能的影响尚待进一步的研究和讨论。

Figure 2.Knockdown of FPR2 reduced the release of pro-inflammatory cytokines in HTR-8/SVneo cells treated with LPS.A：the Western blot results showed the expression of FPR2 was down-regulated in HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2（600 µg/L）；B：the concentrations of IL-6，IL-1β and TNF-α in the supernatant of HTR-8/SVneo cells treated with 100µg/L LPS and 600 µg/L siFPR2 were detected by ELISA.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs si-NC group；△△P＜0.01 vs CON group；#P＜0.05，##P＜0.01 vs LPS group.图2 敲减FPR2可减少LPS诱导的HTR-8/SVneo细胞炎症因子的分泌

本研究表明FPR2 在CAM 胎盘组织中的表达显著增加，提示FPR2 可能参与了CAM 的疾病进程。细菌脂多糖是革兰氏阴性菌细胞壁外壁的主要组成成分，通过与宿主细胞上的特异性受体（Toll like receptor，TLR）结合，引发TNF-α，IL-1β 和IL-6 等炎症因子释放［31］。革兰氏阴性细菌是宫内感染的主要病原菌，近些年来关于LPS 引发滋养细胞炎症反应与早产、复发性流产、子痫前期以及胎儿宫内生长受限等多种不良妊娠相关的研究备受关注［32-33］。因此本研究选择利用LPS 构建体外滋养细胞炎症细胞模型。研究结果发现LPS 显著提高了HTR-8/SVneo 滋养细胞系中FPR2 的表达，这与CAM 患者胎盘组织中FPR2 表达升高的结果相一致；另一方面，FPR2敲减后显著降低了LPS 诱导的HTR-8/SVneo 滋养细胞中促炎因子TNF-α，IL-1β 和IL-6 的分泌，同时FPR2基因敲减改善了LPS 对HTR-8/SVneo 的增殖、凋亡、侵袭、迁移能力的影响。这些研究结果提示，FPR2参与炎症条件下滋养细胞生物学功能的调节，起到促炎作用。本课题组之前发现FPR2 可以与RVD1结合减轻胎盘炎症反应的研究结果，由此推测在CAM 发展过程中，胎盘炎症受多种因素调节，在CAM 早期阶段，胎盘受多种外来病原菌感染，诱发FPR2 产生促炎作用，但随着疾病发展，多种抗炎物质如RVD1 和LXA4 等分泌增加，FPR2 与之结合产生抑炎作用，协助机体消除炎症反应。当然，这些假设需要更多的研究进行证实。

本研究同时探究了炎症状态下FPR2 调控滋养细胞功能的相关信号通路。研究表明，LPS可与细胞膜上的Toll 样受体相互作用，触发多种信号通路。在多种滋养细胞系如HTR-8/SVneo 和JEG3 等中LPS激活细胞膜上Toll 样受体4（Toll like receptor 4，TLR-4），进一步激活下游信号通路如MAPK、NF-κB和STAT 等，促进炎症反应的发生和扩大。其中MAPK（丝裂原活化蛋白激酶）信号通路是调控细胞生长、分化、炎症和应激等多种重要生理效应的经典信号通路［34-35］，主要包括三个分支：ERK、JNK、p38/MAPK。Western blot 结果显示加入LPS 后，HTR-8/SVneo 中p-ERK1/2、p-p38 和p-JNK 表达均有显著增加，但加入siFPR2 后p-ERK1/2 表达显著降低，p-p38和p-JNK 表达没有显著变化。由此推测FPR2 可能通过MAPK/ERK 信号通路调控LPS 对滋养细胞的作用。有研究报道在蛛网膜下出血研究中FPR2 可与外源性LXA4 结合抑制p38 信号通路表达以此缓解炎症反应［36］。但在本研究中，FPR2基因敲除并不改变p38 信号通路表达，这可能是因为不存在配体LXA4的原因。以后的研究将进一步探究FPR2配体与FPR2 间的相互作用在CAM 中的作用及作用机制。明确FPR2 调控滋养细胞生物学功能的信号通路，将为CAM的治疗提供新的靶点。

目前本研究还存在一定的局限性，如缺乏CAM的动物模型，无法通过体内实验探究FPR2的作用机制，另外缺少在原代滋养细胞中进行FPR2功能分析的数据。这些内容将在以后的研究中对这些方面进行进一步的探究。

Figure 3.The effects of LPS on proliferation，apoptosis，invasion and migration of HTR-8/SVneo cells were attenuated after FPR2 was knocked down.A：EdU assay showed that the proliferation of HTR-8/SVneo cells transfected with si-FPR2 was increased（the nuclei were stained with Hoechest in blue and the cells in the proliferation stage were stained with EdU in red）；B：annexin V-FITC/PI staining and flow cytometry were used to determine the percentage of apoptotic cells treated with LPS and LPS+siFPR2；C：representative images of the transwell invasion assay at 12 h in different groups and statistical analysis；D：representative images of wound healing assay of HTR-8/SVneo cells under different conditions at 0 h and 24 h（scale bar=200µm）and statistical analysis. Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs CON group；△△P＜0.01 vs LPS group.图3 敲减FPR2减弱LPS对HTR-8/SVneo细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移的影响

Figure 4.The expression of ERK1/2，JNK and p38 signaling pathway-related proteins detected by Western blot.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs CON group；##P＜0.01 vs LPS group.图4 ERK1/2、JNK和p38信号通路相关蛋白表达情况

综上所述，FPR2 通过MAPK/ERK 信号通路影响滋养细胞生物学功能，在CAM 中发挥重要作用，抑制FPR2的表达可以减轻滋养细胞的炎症损伤，这可为临床CAM的诊治提供参考资料。