高尔基体蛋白ACBD3通过AKT-FOXOs信号通路促进三阴性乳腺癌细胞增殖*

郑迎春，汪 兰

（广东药科大学生命科学与生物制药学院，广东广州 510006）

据2020 年全球世界癌症中心数据统计显示，乳腺癌在女性肿瘤中的发病率居于首位，乳腺癌发病率一度超过肺癌，成为全球最常见的肿瘤［1］。随着临床诊断和治疗方法的不断发展，早期乳腺癌的治疗效果良好，但三阴性乳腺癌（triple-negative breast cancer，TNBC）因易转移和易复发而难以彻底治愈。探索TNBC的细胞特性有助于为其临床治疗提供理论依据［2］。

TNBC 占浸润性乳腺癌的10%～20%，是雌激素受体、孕激素受体和人类表皮生长因子受体2 均不表达的乳腺癌［3］。TNBC 生长迅速且侵袭性较强，易于复发使得预后较差［4］。目前，有大量针对特定受体或TNBC 靶向治疗的临床试验正在进行中，例如，聚腺苷二磷酸核糖聚合酶［poly（ADP-ribose）polymerase，PARP］抑制靶向治疗的研究发现，PARP 抑制剂对BRCA1/2 缺陷型肿瘤具有显著的抗肿瘤作用，对BRCA1 突变型肿瘤的抑制作用比无此类突变肿瘤的抗肿瘤效果显著［5］。雌激素受体α36 在雌激素受体阴性乳腺癌细胞的细胞质和细胞膜中表达，参与调控乳腺癌细胞的恶性进程，存在正反馈环路，作为一个TNBC 治疗的潜在靶点正被深入研究［6］。同时，免疫治疗中的PD-L1和CAR-T疗法在TNBC 的临床治疗中也已由实验室研究迈向临床［7］。综上可知，找到TNBC的关键调控因子对于乳腺癌的靶向治疗和个性化治疗至关重要。

高尔基体是细胞内一个重要的膜性结构，执行多种重要的生物学功能［8］。酰基辅酶A 结合结构域蛋白3（acyl-CoA binding domain containing protein 3，ACBD3），又称GCP60、GOCAP1、GOLPH1 和PAP7，作为一个高尔基体衔接蛋白参与高尔基体结构和功能的维持［9］。研究发现，ACBD3 可参与类固醇代谢、细胞凋亡、铁平衡、胚胎发育及细胞周期调控［10-11］。高尔基体蛋白可用于临床筛查及预后判断，如胆管上皮细胞高尔基体蛋白73 可用于协助诊断肝纤维化和肝硬化［12］；ACBD3 在非小细胞肺癌中表达上调预示较差的治疗效果。但ACBD3 在TNBC 增殖中的功能及机制尚不清楚。

磷脂酰肌醇3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）信号通路调控细胞增殖及存活，在肿瘤的发生、发展过程中至关重要［13-14］。叉头框蛋白O（forkhead box O，FOXO）转录因子受PI3K-AKT 信号通路负调控，经AKT 磷酸化后使其活性下降，在细胞增殖中起到负性调控作用［15］。然而，ACBD3 与增殖关键信号通路AKT 的关系尚无研究报道。本研究首次探讨了ACBD3通过活化AKT进而调控TNBC细胞的增殖。

材料和方法

1 细胞株

人乳腺癌细胞系MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT549 和MDA-MB-231 及永生化正常乳腺上皮细胞系MCF-10A均为中山大学热带病防治研究教育部重点实验室提供［16］。

2 主要试剂

DMEM 粉末、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）和无血清角质细胞培养基（keratinocyte serum-free medium，KSFM）均购自Gibco；PCR 及逆转录试剂盒（Vazyme）；鼠抗人ACBD3 抗体（sc-101277）购自Santa Cruz；鼠抗人GAPDH 抗体（ab8245）和兔抗人p-FOXO4Ser193抗体（ab174849）购自Abcam；MTT 粉末、ECL 发光液粉末和Hoechst 33342 细胞核染料（Sigma）；兔抗人p-AKTSer473抗体（9271S）、p-AKTThr308抗体（4056S）、AKT 抗体（9272S）、FOXO4 抗体（9472S）、p-FOXO3aSer253抗体（9466S）、FOXO3a 抗体（9466S）、p-FOXO1Ser256抗体（9461S）、p-GSK3β（9322S）抗体和GSK3β 抗体（12456S），鼠抗人FOXO1 抗体（14952S）均购自Cell Signaling Technology；细胞周期检测试剂盒（RiboBio）；BCA 蛋白定量试剂盒（Thermo Fisher）；ACBD3引物序列由金唯智生物科技有限公司合成。

3 实验方法

3.1 细胞培养 MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231 细胞均使用含10% FBS 的完全培养基进行培养，MCF-10A 细胞使用KSFM 培养基进行培养，将所有细胞置于37 ℃、5% CO2的培养箱中进行培养。

3.2 qPCR 和Western blot 验证乳腺癌细胞中ACBD3 的表达 胰酶消化接种于6 孔板中的MDAMB-231、BT-549 及MCF-10A 细胞，分别提取各组细胞的RNA 及蛋白，使用qPCR 及Western blot 法分别检测ACBD3 在各组细胞中的mRNA 和蛋白表达。ACBD3 上游引物序列为5'-ACAGTATCCAGGGAACTACGAA-3'，下游引物序列为5'-GTTTCTGTAATGCTGCCGTTG-3'；内参照GAPDH 的上游引物序列为5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'，下游引 物序列为5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'。

3.3 构建沉默ACBD3的TNBC 细胞系模型 选取TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549，分为2 组：（1）对照（RNAi-Vector）组：转染RNAi-Vector 质粒，转染浓度为1 g/L，构建为MDA-MB-231-RNAi-Vector 细胞和BT-549-RNAi-Vector细胞；（2）ACBD3沉默（ACBD3-RNAi）组：转染ACBD3-RNAi 质粒，转染浓度为1 g/L，构建为MDA-MB-231-ACBD3-RNAi 细胞和BT-549-ACBD3-RNAi 细胞。ACBD3-RNAi 的序列为5'-AUUGAUGGCUGCCAGCAUACACCUC-3'，所使用质粒载体为pSUPER.retro.puro（Oligoengine）［17］。本文中所使用的载体制备及实验技术均按Oligoengine 公司pSUPER载体实验指南操作。

3.4 MTT 法检测ACBD3 对乳腺癌细胞活力的影响 取对数生长期的MDA-MB-231和BT-549细胞及其构建成功的ACBD3-RNAi 细胞，分别以每孔2×103个接种于96孔板中，每组设置3个复孔，分别培养0、24、48、72 和96 h 后，每孔加入18µL MTT 溶液（浓度为5 g/L），放置于37 ℃孵育4～6 h，弃去上清，每孔加入160 µL 的DMSO 溶液，避光震荡使孔板底部蓝紫色结晶充分溶解，490 nm 波长处检测吸光度，使用GraphPad Prism绘制细胞生长曲线。

3.5 平板集落形成实验 取MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其构建成功的ACBD3-RNAi 细胞，分别以每孔500 个接种于12 孔板中，置于37 ℃孵箱培养14 d，弃去上清，每孔加入500µL甲醇固定30 min，使用PBS 清洗2 次，加入1%的结晶紫溶液染色10 min，回收结晶紫溶液，并使用流动水冲洗孔板，直至清水无色后，室温晾干孔板，进行集落数目统计。

3.6 EdU 染色检测ACBD3 对乳腺癌细胞增殖的影响 取MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其ACBD3-RNAi细胞，分别以每孔2×104个接种于12孔板中，细胞放置于37 ℃孵箱培养24 h，每孔加入200µL EdU标记物孵育2 h；使用PBS 清洗3 次，加入250 µL 的4%多聚甲醛固定30 min；使用PBS 清洗2 次，每孔加入300 µL 的5% Triton X-100，孵育10 min；使用PBS清洗2 次，加入250µL 的Apollo 荧光染料，避光孵育30 min；每孔加入250µL 的5%Triton X-100，孵育10 min，重复2 次；使用PBS 清洗1 次，每孔加入250 µL的Hoechst 33342染色液孵育30 min，使用PBS清洗2次；晾干细胞爬片，使用防淬灭封片剂进行封片，荧光显微镜20倍镜进行拍照。

3.7 流式细胞术检测细胞周期分布 将MDA-MB-231 和BT-549 细胞及其ACBD3-RNAi 细胞以每孔5×105个接种于6 孔板内，置于37 ℃、5% CO2培养箱内过夜，次日加入基础培养基同步化处理24 h 后换为含有10% FBS 的完全培养基处理24 h。使用不含EDTA 的胰酶消化细胞，每组细胞内加入1 mL 提前预冷的70%乙醇吹打混匀于4 ℃固定过夜。次日，使用PBS 清洗3 次，加入500 µL 染色液（RNase A 与PI 体积比为1∶9），重悬细胞并使用滤网过滤至流式管中染色30 min，激发波长488 nm 处上机检测各个细胞周期的变化。

3.8 构建小鼠荷瘤模型 皮下接种乳腺癌细胞至小鼠乳房垫，构建小鼠异种种植模型，每只接种2×106个MDA-MB-231 细胞及其ACDB3-RNAi 细胞或1×107个BT-549 细胞及其ACDB3-RNAi 细胞，注射体积均为100µL。实验终点结束后对小鼠进行脱颈处死，并剥离小鼠肿瘤进行拍照、称重及数据统计分析。

4 统计学处理

采用GraphPad Prism 5 软件进行统计分析，所有数据结果以均数±标准差（mean±SD）表示。两组间的比较在正态性检验之后用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA；Version 4.0.3；https：//www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp）。

结果

1 qPCR 和Western blot 法检测ACBD3 在TNBC细胞中的表达

本课题组先前研究通过TCGA（The Cancer Genome Atlas）公共数据库分析ACBD3在乳腺癌组织及正常乳腺上皮组织中的数据，发现ACBD3 在乳腺癌组织中的表达水平明显高于正常乳腺上皮组织［18］。本实验中，我们对乳腺癌病例中的TNBC和其他类型乳腺癌中的ACBD3 进行了分组对比分析。我们选取正常乳腺上皮细胞（MCF-10A）和5 株乳腺癌细胞系（MCF-7、ZR-75-30、SK-BR-3、BT-549 和MDA-MB-231）并收集其RNA 及蛋白，利用qPCR 和Western blot 法分别检测ACBD3 的mRNA 及蛋白表达水平。实验结果表明，在所有乳腺癌细胞系中ACBD3 的mRNA 及蛋白表达水平均显著高于正常乳腺上皮细胞（P＜0.05 或P＜0.01），其中TNBC 细胞系MDA-MB-231及BT-549中ACBD3的表达水平比其他类型的乳腺癌细胞更高（P＜0.01），见图1。

2 ACBD3能够促进TNBC细胞增殖

通过qPCR 和Western blot 实验验证TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 及其ACBD3-RNAi 细胞中ACBD3 的表达水平（P＜0.01），见图2A、B。MTT 实验结果证明，ACBD3 能够显著促进TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的生长速度，与RNAi-Vector组相比，敲减内源性ACBD3的表达能够显著抑制TNBC 细胞的生长（P＜0.01），见图2C。平板集落形成实验结果证明，ACBD3 能够显著增加TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的集落形成能力，与RNAi-Vector 组相比，敲减内源性ACBD3的表达则能够显著抑制TNBC 细胞的集落形成能力（P＜0.01），见图2D。EdU 细胞增殖检测结果证明，ACBD3 能够显著促进TNBC 细胞系MDA-MB-231 和BT-549 的增殖能力，与RNAi-Vector 组相比，敲减内源性ACBD3的表达能够显著抑制TNBC 细胞的增殖能力（P＜0.01），见图2E。

Figure 1.The mRNA and protein levels of ACBD3 in normal breast epithelial cells and breast cancer cells were tested by qPCR（A）and Western blot（B）.Mean±SD. n=3.*P＜0.05，**P＜0.01 vs MCF-10A group.图1 正常乳腺上皮细胞及乳腺癌细胞中ACBD3的mRNA及蛋白表达情况

3 ACBD3能够促进乳腺癌细胞G1/S期转变

流式细胞术结果证明，ACBD3 能够促进TNBC细胞系MDA-MB-231和BT-549的细胞周期进展。与RNAi-Vector 组相比，当敲减内源性ACBD3表达后，各组细胞中G0/G1期的比例增加，S 期的比例减少。与RNAi-Vector 组相比，MDA-MB-231 细胞的G0/G1期比例由35.05%增加至64.45%，S 期比例由36.80%减少至18.83%；BT-549 细胞的G0/G1期比例由35.82%增加至58.23%，S 期比例由40.63%减少至23.48%（P＜0.01），见图3。

4 ACBD3体内促进TNBC细胞增殖

为进一步验证ACBD3 在小鼠体内的生物学功能，通过接种TNBC 细胞待其成瘤，观察各个细胞系中RNAi-Vector 组与ACBD3-RNAi 组小鼠肿瘤体积大小的变化情况。小鼠肿瘤实验结果证明，ACBD3能够促进小鼠体内肿瘤的生长。与RNAi-Vector 组相比，敲减内源性ACBD3表达能够显著抑制肿瘤细胞生长，见图4A。此外，通过测量记录小鼠肿瘤体积曲线及肿瘤重量发现，ACBD3 能够促进小鼠体内肿瘤的增殖及成瘤，与RNAi-Vector 组相比，敲减内源性ACBD3能够显著抑制肿瘤细胞增殖及成瘤（P＜0.05或P＜0.01），见图4B、C。

5 ACBD3表达与AKT-FOXO信号通路相关

通过GSEA 发现ACBD3的高表达与AKT活化的基因群相关，与FOXO3 负调控的富集基因群相关（P＜0.05 或P＜0.01），见图5A。此外，Western blot 结果显示，ACBD3 能够促进AKT、GSK3β 及FOXOs 等蛋白的磷酸化。与RNAi-Vector 组相比，敲减内源性ACBD3的表达能够显著降低AKT、GSK3β 及FOXOs等蛋白的磷酸化水平（P＜0.01），见图5B。

讨 论

高尔基复合体是细胞执行生物学功能的重要场所，参与调节蛋白质和脂质的修饰，运输及分选［19］。ACBD3基因位于人类染色体1q42.12，其蛋白是一个高尔基体衔接蛋白，主要负责维护高尔基体的结构和功能，且在内质网输出蛋白的分选和修饰中起关键作用［20-21］。先前研究表明，ACBD3 可以与多种分子相互作用，如PI4KB、Golgin45、TBC1D22、PPM1L、DMT1、PKA、FAPP2、TUG、PARP-1和Numb以及一些细菌和病毒蛋白等［22］。微阵列数据显示，ACBD3 参与调控细胞周期，已有研究表明ACBD3 可通过调控不对称细胞分裂中的Numb信号通路，从而调控细胞周期［18，23］。除此之外，研究报道ACBD3 在病毒及细菌复制中发挥重要作用。但ACBD3 在乳腺癌细胞发生发展中的具体生物学功能及分子机制研究甚少。

Figure 2.ACBD3 promoted the proliferation of triple-negative breast cancer（TNBC）cells in vitro.A：the mRNA expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by qPCR；B：the protein expression of ACBD3 in the indicated TNBC cells transfected with RNAi-Vector and ACBD3-RNAi was detected by Western blot；C：the cell viability was measured by MTT assay；D：the growth of the cells was detected by colony formation assay；E：the proliferation of TNBC cells was detected by EdU staining.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.图2 ACBD3可促进三阴性乳腺癌细胞增殖

已有的研究发现，TNBC 中通常伴有PTEN、TP53、PIK3CA、KRAS、BRAF、EGFR、FGFR1、FGFR2、IGFR1、KIT或MET等突变［24］。例如PTEN是10q23染色体上的肿瘤抑制基因，是PI3K-AKT 信号通路激活的关键调控因子之一，而PI3K-AKT 信号通路参与多种肿瘤的发生发展过程，其也是乳腺癌预后判断的重要分子［25］。此外，有研究发现ACBD3 可通过调节PI4Kβ 从而参与调控细胞自噬［10］。在多种肿瘤中沉默ACBD3或PRKAR1A（protein kinase A regulatory subunit type 1A）表达可诱导肿瘤细胞的生长抑制和凋亡，并伴有丝裂原活化蛋白激酶、PI3K-AKT 和JAK-STAT 等通路信号传导的减少［26-28］。本研究发现，ACBD3 在TNBC 细胞中的表达水平高于其他类型乳腺癌细胞，通过细胞生物学实验证明ACBD3 能够促进TNBC细胞生长及增殖。

FOXO 转录因子受PI3K-AKT 信号通路负调控，被认为对细胞增殖有抑制作用［27］。FOXOs 的4 种亚型（FOXO1、FOXO3、FOXO4 和FOXO6）具有较高的蛋白同源性，均受到AKT 蛋白调控［29］。FOXO1、FOXO3 和FOXO4 转录因子可被AKT 直接磷酸化并被抑制转录，在AKT 调控细胞增殖的过程中发挥着重要作用［30］。本研究发现ACBD3 能够调控AKTFOXOs 信号通路促进TNBC 细胞的增殖能力，沉默内源性ACBD3则能够抑制其增殖能力。

综上所述，本研究发现ACBD3 在TNBC 细胞中高表达，能够通过AKT-FOXOs 信号通路调控TNBC细胞的增殖能力，在TNBC的发生发展中发挥着重要作用。

Figure3.ACBD3 promoted the G1/S phase progression of triple negative breast cancer（TNBC）cells in vitro.The G1/S phase progression of TNBC cells was detected by flow cytometry analysis.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.图3 ACDB3促进三阴性乳腺癌细胞G1/S期转变

Figure 4.ACBD3 promoted the proliferation of triple negative breast cancer cells in vivo.A：tumor photos analysed by Canvas；B and C：analysis of tumor volume and weight by GraphPad Prism.Mean±SD. n=6.*P＜0.05，**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.图4 ACBD3体内促进三阴性乳腺癌细胞增殖

Figure 5.The effect of ACBD3 on AKT-FOXOs pathway in triple negative breast cancer cells.A：the results of gene set enrichment analysis（GSEA）showed that ACBD3 expression was positively correlated with proliferation and cell cycle-activated gene signatures（ACBD3-H：high expression of ACBD3；ACBD3-L：low expression of ACBD3）；B：the protein levels of AKT，GSK3β and FOXOs were examined by Western blot.Mean±SD. n=3.**P＜0.01 vs RNAi-Vector group.图5 ACBD3对三阴性乳腺癌细胞中AKT-FOXOs信号通路的影响