荧光分光光度法测定蜜饯食品中二氧化硫残留量研究

李长滨，王钊，刘文静，吴圣江

(1.河南牧业经济学院 食品与生物工程学院，郑州 450046；2.河南华测检测技术有限公司，郑州 453100)

亚硫酸盐是食品工业中广泛使用的一种食品添加剂，可作为食品漂白剂、防腐剂和抗菌剂，也可抑制非酶褐变和酶促褐变，常用于食品的护色、防腐、漂白、抗氧化以及延长食品货架期等方面[1]。亚硫酸盐可以与食品中的水生成亚硫酸、硫酸、二氧化硫等物质，其中二氧化硫可以参与人体血液循环，破坏细胞酶活力，引起体内碳水化合物和蛋白质的代谢异常，人体在二氧化硫中毒后，机体的免疫功能严重受损。二氧化硫还会刺激呼吸道平滑肌发生收缩，从而引起一系列呼吸道疾病[2-3]。

蜜饯是以果蔬为原料，经糖、蜂蜜或食盐腌制而成的传统食品，其制作过程大都添加亚硫酸盐类物质以防止蜜饯发生褐变，保持产品色泽鲜艳，延长其货架期[4]。蜜饯类休闲食品，诸如芒果干、草莓干、杨梅干、蓝莓干、半梅等其配料表中均明确标注了焦亚硫酸钠，因此蜜饯类食品中二氧化硫残留量的检测是保障其安全的重要手段。国标GB 5009.34—2016《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》中规定了二氧化硫的测定方法为滴定法[5]，该方法存在滴定终点不灵敏、重现性与准确性较差的劣势，而且样品处理需要蒸馏，操作过程较为繁琐，不适合批量样品的检测。另有研究报道，高效液相色谱法、气相色谱法、蒸馏碘量法等用于二氧化硫残留的量测定[6]，色谱法具有重现性好、灵敏度高等优点，但是存在仪器昂贵、检测费用较高等缺点。顾娉婷[7]使用全自动蛋白测定仪对国标法进行改进，简化了蒸馏过程，但是试验结果表明使用改进后的方法与国标法并没有显著差别。此外，还有利用比色法、表面增强拉曼光谱法、电化学法、荧光探针法以及试剂盒等快检法对二氧化硫进行测定和分析[8-14]。比色法准确度低、容易受周围环境影响且试验过程需使用有毒试剂，拉曼光谱法和电化学法具有重复性差的缺点，荧光探针法使用范围受限，试剂盒等快检方法具有准确度低的劣势[15]。寻求一种简单、快捷且同时适合大批量样品测定的方法意义重大。荧光分析法具有灵敏度高、选择性强、操作简便、测定样品使用量少等优点，因而被广泛应用于微量元素、重金属元素、特异性荧光化合物等的定性及定量分析[16-17]，通过荧光分光光度法试验条件的优化，建立一种蜜饯食品中二氧化硫残留量的检测方法，为蜜饯类产品的质量控制以及产品检测提供了更多选择。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蜜枣、葡萄干、话梅、芒果干、蓝莓干：郑州市丹尼斯超市；亚硫酸钠(分析纯)：天津市德恩化学试剂有限公司；邻苯二甲醛(分析纯)：上海易恩化学技术有限公司；乙酸铵(分析纯)：广东光华化学厂有限公司；十二水合磷酸氢二钠(分析纯)：西陇化工股份有限公司；磷酸二氢钾(分析纯)：天津市恒兴化学试剂制造有限公司；无水乙醇(分析纯)：国药集团化学试剂有限公司；试验用水为去离子水。

1.2 试验仪器

F380荧光分光光度计 天津港东科技股份有限公司；FA1004电子分析天平 上海舜宇恒平科学仪器有限公司；HH-6恒温水浴锅 上海高致精密仪器有限公司；ZL22-500A超声波振荡仪 上海左乐仪器有限公司；JJ-2BS破壁机 美的科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 样品前处理

分别将蜜枣、葡萄干、话梅、芒果干、蓝莓干用破壁机粉碎成小块，再准确称量5.0000 g，加入0.5%的氢氧化钠溶液100 mL，超声提取 30 min后以8000 r/min 离心5 min，取上清液1.0 mL 用水稀释至10 mL，待用。

1.3.2 最佳激发波长和发射波长的确定

吸取已配制好的相当于10 μg/mL二氧化硫的亚硫酸钠标液1.0 mL置于50 mL容量瓶中，依次加入pH为6.6的缓冲溶液、1.0 mmol/L邻苯二甲醛溶液、5.0 mmol/L乙酸铵溶液各2.0 mL，定容混匀，置于50 ℃恒温水浴锅中加热反应10 min后取出，放入冷水中终止反应，静置30 min后取出，使用荧光分光光度计扫描吸收光谱和发射光谱，由此得出最佳激发波长和发射波长。

1.3.3 亚硫酸钠标准溶液的配制

将浓度为100 μg/mL的亚硫酸钠标品稀释成浓度为1 μg/mL的亚硫酸钠储备液，使用时移取0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL亚硫酸钠储备液分别置于50 mL容量瓶中，依次加入pH为6.6的磷酸盐缓冲溶液、1.0 mmol/L邻苯二甲醛溶液和5.0 mmol/L乙酸铵溶液各2.0 mL，定容混匀，再将其置于50 ℃恒温水浴锅中加热10 min后立即取出，放入冷水中终止反应，静置30 min后在激发波长为324 nm、发射波长为390 nm的条件下，以荧光强度为纵坐标、二氧化硫的浓度为横坐标，绘制亚硫酸钠标准曲线。

1.3.4 试验条件对结果的影响

1.3.4.1 单因素试验

分别探究缓冲液pH值(6.2，6.4，6.6，6.8，7.0)、缓冲液添加量(1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，3.5 mL)、邻苯二甲醛溶液用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)、乙酸铵用量(0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0 mL)对荧光强度的影响。

1.3.4.2 正交试验

根据单因素试验结果，探究缓冲液pH、邻苯二甲醛溶液用量、乙酸铵溶液用量之间交互作用对反应产生荧光强度的影响，根据单因素试验所得最优结果设计三因素四水平正交试验，寻找优化方案并进行极差、方差分析。

1.3.5 二氧化硫残留量计算

式中：X为二氧化硫含量，mg/kg；C为标曲计算得出的二氧化硫浓度，μg/mL；V提取为样品提取时使用超纯水体积，mL；V定容为反应定容体积，mL；V吸取为吸取样品提取液体积，mL；M称量为样品称量质量，g。

2 结果与分析

2.1 激发波长和发射波长的确定

设定仪器发射波长为386 nm，扫描激发波长，发现在324 nm处出现最大激发光谱峰，设定激发波长为324 nm，扫描发射波长，在390 nm处出现最大发射光谱峰，见图1。

图1 激发发射扫描光谱图

根据扫描结果，设定荧光分光光度计参数：激发波长为324 nm，发射波长为390 nm，激发波长狭缝为5.0 nm，发射波长狭缝为5.0 nm，PMT电压为400 V，增益指数为2，曝光时间为0.1 s，延迟0 s。

2.2 荧光化合物生成条件优化

2.2.1 缓冲液pH值及用量的影响

缓冲液pH值的大小及添加量对体系荧光强度的影响见图2。

图2 缓冲液pH值及添加量对荧光强度的影响

由图2可知，pH范围在6.0～6.2之间时，荧光强度增加幅度并不明显，pH在6.2～6.4之间时，荧光强度呈指数性增加，缓冲溶液的pH为6.4时，体系荧光强度达到最大值322，pH在6.4～6.6之间时，荧光强度缓慢减小，pH再增加时，该数值加剧减小。方差分析结果显示，缓冲液pH值为6.6与pH值为6.4和6.8对应的荧光强度大小有显著性差异(P<0.05)，缓冲溶液的pH为6.4较适宜。

在缓冲溶液添加量范围在1.0～3.5 mL之间时，随着缓冲溶液添加量的增加，荧光强度先增大后减小，当缓冲溶液的添加量为2.0 mL时，荧光强度达到最大值，随后和pH值呈负相关。原因可能是在特定pH值条件下分子有稳定的结构和立体构像，pH值变大和变小均会导致荧光强度降低[18]。方差分析结果显示，缓冲溶液添加量为2.0 mL与添加量为1.5，2.5 mL对荧光强度有显著差异(P<0.05)，因此选择缓冲溶液添加量为2.0 mL。

2.2.2 邻苯二甲醛用量的影响

邻苯二甲醛用量对体系荧光强度的影响见图3。

图3 邻苯二甲醛添加量对荧光强度的影响

由图3可知，随着邻苯二甲醛添加量的增加，体系荧光强度先增加后降低，邻苯二甲醛添加量在0.5～2.0 mL之间时，其荧光强度基本呈线性增加，为邻苯二甲醛添加量为2.0 mL时，荧光强度达最大值420.54。而邻苯二甲醛添加量超过2.0 mL之后，荧光强度的数值迅速减小，原因可能是邻苯二甲醛添加量过大，荧光物质分子易与溶剂分子相互作用发生荧光猝灭效应，或荧光物质在样品池中分布不均匀发生内滤效应，从而导致荧光强度变低[19]。方差分析结果显示，邻苯二甲醛添加量为2.0 mL和添加量为1.5，2.5 mL有显著性差异(P<0.05)，因此，邻苯二甲醛加入量为2.0 mL较适宜。

2.2.3 乙酸铵用量的影响

乙酸铵用量对体系荧光强度的影响见图4。

图4 乙酸铵添加量对荧光强度的影响

由图4可知，体系荧光强度随着乙酸铵用量的增加呈现先增大后减小的趋势，当乙酸铵加入量为1.5 mL时，荧光强度达最大值268.494。乙酸铵用量在0.5～1.5 mL时，体系的荧光强度逐渐增大，乙酸铵用量超过1.5 mL之后，荧光强度的数值呈减小趋势。原因可能是乙酸铵属于强电解质，易水解，添加量过大吸电子基团COO-会削弱电子共轭性，荧光强度减弱[20]。方差分析结果显示，乙酸铵用量为1.5 mL和用量为1.0，2.0 mL有显著性差异(P<0.05)，因此，乙酸铵加入量为1.5 mL较适宜。

2.2.4 正交优化试验条件

2.2.4.1 正交试验及结果

根据单因素试验结果，为探究磷酸盐缓冲溶液pH值、邻苯二甲醛加入量、乙酸铵加入量之间的交互作用对生成荧光强度的影响，设计正交试验，对反应条件进行优化。根据单因素试验结果设计正交条件(见表1)，试验结果见表2。

表1 三因素四水平正交试验设计表

表2 正交试验设计结果

由表2可知，在荧光化合物生成过程中，缓冲溶液pH(A)对荧光强度的影响最大，其次是乙酸铵加入量(C)，影响较小的是邻苯二甲醛加入量(B)；从均值结果可以看出，最佳条件组合是A3B3C3，即缓冲液pH值为6.6，邻苯二甲醛加入量为2.0 mL，乙酸铵加入量为2.0 mL时，荧光强度的效果最佳。

2.2.4.2 正交试验方差分析

对反应条件三因素四水平正交试验的结果使用SPSS进行方差分析，数据分析结果见表3，利用多因素方差分析研究缓冲液pH、邻苯二甲醛用量、乙酸铵用量对荧光强度的差异影响，由显著性分析可知缓冲液pH值会对荧光强度产生显著性差异影响(P<0.05)，而邻苯二甲醛用量(P=0.859)、乙酸铵用量(P=0.361)并不会对荧光强度产生差异影响。

表3 方差分析结果

2.3 亚硫酸钠标准曲线绘制

对1.3.3中配制的溶液在激发波长324 nm、发射波长390 nm的条件下测定每个溶液的荧光强度，以亚硫酸盐的浓度为横坐标、荧光强度为纵坐标绘制标准曲线，见图5。

图5 亚硫酸钠标准曲线

由图5可知，亚硫酸钠标准曲线回归方程为y=290.92x+89.163，线性相关系数R2=0.9993，其拟合程度高，可以用于二氧化硫含量的计算。

2.4 样品二氧化硫含量检测

按1.3.1步骤处理样品，然后按照1.3.3添加相应的衍生化试剂后测定蜜枣、葡萄干、话梅、芒果干、蓝莓干中二氧化硫残留量。每个样品平行测定5次，结果见表4。

表4 5种样品中二氧化硫残留量测定结果

由表4可知，在优化后的条件下测定蜜枣二氧化硫平均残留量为35.731 mg/kg，蓝莓干二氧化硫平均残留量为13.087 mg/kg，话梅二氧化硫平均残留量为300.542 mg/kg，葡萄干二氧化硫平均残留量为127.092 mg/kg，芒果干二氧化硫平均残留量为189.961 mg/kg，5种蜜饯样品的相对标准偏差RSD介于0.83%～4.59%之间，结果表明该方法的精密度较好。根据3倍标准偏差计算可知，荧光分光光度法测定二氧化硫检出限为0.644 mg/kg。

2.5 方法学验证

2.5.1 回收率试验

取各类样品各3份，分别加入100 μg/mL亚硫酸钠使用液1.0 mL，测定荧光强度，计算加标回收率以及平均回收率，结果见表5。

表5 加标回收结果

由表5可知，5组样品的加标回收率在93.35%～106.50%之间，平均回收率在97.68%～102.71%之间，说明该检测方法有良好的准确性。

2.5.2 稳定性试验

分别取蜜枣、葡萄干、话梅、芒果干、蓝莓干样本待测液，按照测定二氧化硫的方法测定其在0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h的荧光强度值。结果发现2.5 h以内5种样本的荧光强度稳定性好，RSD范围在1.76%～2.64%之间，表明5种样本的避光保存稳定时间为2.5 h。

2.5.3 国标检测方法比对

国标GB 5009.34—2016《食品安全国家标准 食品中二氧化硫的测定》规定方法为滴定法，为了进一步验证荧光光度法的准确性和适用性，同时将5个样品用国标方法进行测定，每个样品平行测定5次，并将结果进行对比和差异分析，结果见表6。

表6 荧光分光光度法与国标方法比较

由表6可知，荧光分光光度法和国标法测定二氧化硫的结果无显著差异(P>0.05)，且荧光分光光度法建立的测定二氧化硫的分析方法精密度更好，结果准确可靠，适合蜜饯类食品中二氧化硫残留量的测定。

3 结论

本研究使用荧光分光光度计建立一套测定蜜饯食品中二氧化硫残留量的新方法，通过扫描光谱发现最佳激发波长为324 nm，最佳发射波长为390 nm。对荧光化合物生成过程中缓冲液pH和添加量、邻苯二甲醛加入量、乙酸铵加入量4个因素进行优化。最终确定最佳因素条件为缓冲液pH为6.6，邻苯二甲醛用量、乙酸铵用量均为2.0 mL。根据优化条件绘制亚硫酸钠标准曲线，得到回归方程为y=290.92x+89.163，线性相关系数R2=0.9993。对蜜枣、蓝莓干、话梅、葡萄干、芒果干5个样品进行二氧化硫残留量检测，二氧化硫残留量均值分别为35.731，13.087，300.542，127.092，189.961 mg/kg，均未超过国标要求的350 mg/kg。5种样品的相对标准偏差RSD介于0.83%～4.59%之间，加标回收率均值在97.68%～102.71%之间，说明该方法有较好的准确性和精密性。通过和国标方法检测结果比对，结果证明荧光分光光度法的精密度更好，结果准确可靠，可用于测定蜜饯食品中二氧化硫残留量的分析。