Kefir主发酵剂的配比优化及产品风味物质组分分析

肖冉，惠明,*，田青，黄继红

(1.河南工业大学 生物工程学院，郑州 450001；2.工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室，郑州 450001)

Kefir是一种源于北高加索地区风味独特的含酒精低热量、低乳糖发酵乳饮品[1-3]，由于其多菌种协同发酵并且有酒味的特点，也被誉为发酵乳中的香槟[4-5]。Kefir目前在市场上还不常见，虽然有个别产品也标明是“开菲尔”，但从其发酵菌种及产品特色来看，与传统意义上的Kefir相差甚远。常见的Kefir发酵剂被称为Kefir粒，其中微生物菌相复杂。有研究表明，Kefir粒中酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等占主导地位[6-8]。也正因如此，发酵条件略有不同就可能造成不同批次的Kefir乳风味及状态不稳定、CO2产气量过多、易胀袋、营养成分差异大等问题[9-10]。因此，本文尝试以牛乳为主要原料，通过接种自选酵母菌、乳酸菌、醋酸菌等不同配比的优势菌剂模拟发酵制备Kefir乳，并借助感官品评、理化分析及SPME-GC-MS技术等来考察不同菌种之间的比例及相互协同作用，各自代谢物对产品风味物质形成、产品特性的影响等，以期为下一步的Kefir产品开发、品质控制及市场普及提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

植物乳杆菌L1(简称L1)、酵母菌TN1(简称TN1)、醋酸杆菌A3(简称A3)：均由工业微生物菌种保藏与选育河南省工程实验室筛选和提供。

1.1.2 原料及试剂

蛋白胨、牛肉膏、酵母浸粉、葡萄糖：北京奥博兴生物技术有限责任公司；磷酸氢二钾、柠檬酸二铵、乙酸钠、吐温80、硫酸镁、硫酸锰、氯化钠、氢氧化钠、酚酞：天津市科密欧化学试剂有限公司；纯牛奶：内蒙古蒙牛乳业股份有限公司；白砂糖：郑州市大型连锁超市。

1.1.3 培养基

MRS培养基参考文献[11]，YPD培养基参考文献[12]。

1.2 仪器与设备

pH计 梅特勒-托利多仪器有限公司；高压灭菌锅 厦门致微仪器有限公司；Trace 1300 GC/MS联用仪 美国赛默飞世尔科技公司；手动固相微萃取进样器(SPME手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头)、DB-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm)弹性石英毛细管色谱柱 江苏默克仪器有限公司；ZQZY-CS全温恒温培养摇床、ZXSD-A1160恒温培养箱 上海智城分析仪器制造有限公司；TA.XT Plus质构仪 美国Stable Micro System公司。

1.3 试验方法

1.3.1 基础发酵试验

菌种活化：A3和L1菌株用MRS液体培养基活化；TN1菌株用YPD液体培养基活化。

发酵试验：取若干100 mL锥形瓶分别添加50 mL纯牛奶、2.5 g白砂糖，经巴氏杀菌(62 ℃，30 min)后放凉，接种7%的发酵剂，混匀，于37 ℃恒温培养12 h至发酵完成后转移至4 ℃冰箱后熟过夜[13]。发酵中考察不同的菌种配比组合：A(L1+TN1)、B(L1+A3)、C(A3+TN1)，其中：L1菌数为4.1×108CFU/mL，TN1菌数为8.1×107CFU/mL，A3菌数为2.9×108CFU/mL。

1.3.2 发酵乳菌种添加比例的单因素试验

经前期试验发现，醋酸杆菌A3及酿酒酵母TN1单一菌种发酵牛奶产品均不具备酸奶的品质，因此先进行A3、L1、TN1两两不同比例组合试验，在此基础上优化三菌种组合，借以考察复合菌种发酵产品的感官特征及风味物质种类，基本方案如下：

将活化后的A组(L1+TN1)按照1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20、1∶0.25的比例、B组(L1+A3)按照1∶0.40、1∶0.60、1∶0.80、1∶1.00、1∶1.20的比例和C组(A3+TN1)按照1∶0.05、1∶0.10、1∶0.15、1∶0.20、1∶0.25的比例分别接种于已杀菌的牛奶中，37 ℃恒温培养12 h至发酵完成后转移至4 ℃冰箱后熟过夜。以感官评价为指标，确定A组、B组、C组较佳的添加比例。

1.3.3 发酵乳菌种添加比例的Box-Behnken 试验设计

响应面优化方法参考文献[14-16]。通过单因素试验确定了A组、B组、C组的最佳水平范围，在此基础上利用Design-Expert 12.0 软件制作Box-Behnken试验设计，进行三因素三水平响应面试验，因素水平见表1。

表1 Box-Behnken试验设计因素水平

1.3.4 验证试验

对优化后的结果进行验证试验，并与预测结果进行比较，确定三菌种混合发酵制备Kefir的最佳发酵剂比例。

1.3.5 发酵乳pH测定

发酵乳pH按照文献[17]的方法测定。

1.3.6 滴定酸度测定

发酵乳滴定酸度按照文献[18]的方法测定。

1.3.7 发酵乳持水率测定

准确称取20 g后熟后的酸乳，置于50 mL离心管中，在4 ℃条件下从3800 r/min离心20 min后除上清液，称剩余沉淀物质量[19]，按式(1)计算：

(1)

1.3.8 发酵乳乳清析出量测定

将30 g酸乳样品，在4 ℃以12000 r/min条件下离心20 min，收集滤出的乳清[20]，按式(2)计算：

(2)

1.3.9 GC-MS比较不同发酵风味物质的变化

取酸奶样品3 g 缓慢加入到100 mL的锥形瓶中，加入21 mL饱和食盐水，吸取20 μL的0.09 g/L内标物(2-辛醇)加入样品，密封严密。平衡时间10 min，温度45 ℃，萃取45 min，解吸3 min后进行检测。

GC条件：采用程序升温方式，由常温升至40 ℃，保持1 min,以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至210 ℃，保持5 min；进样口温度250 ℃；传输线温度215 ℃；载气为He，流速1.0 mL/min；分流比20∶1进样。

MS条件：电离方式EI，70 eV；离子源温度280 ℃，质量扫描范围35～450 amu；发射电流100 μA，检测电压1.4 kV[21]。

1.3.10 不同酸奶的质构分析

将优化组(L1TN1A3)与L1样品于 4 ℃冰箱中后熟过夜后取出，进行对比分析[22]。采用TA.XT Plus质构仪测定样品质构参数。采用 TPA 模式测试，选用P/50探头，测试距离为25 mm，触发点为 5.0 g，测前速度为2 mm/s，测中速度为 2 mm/s,测后速度为6 mm/s。测定指标包括硬度、回弹性、内聚性、黏性、咀嚼性、弹力。

1.3.11 发酵乳的感官评价

感官评价由五部分组成，由10名成员进行评估，结果取平均值，本评定均在自然光下室温状态观察发酵乳的组织状态、色泽及气味，用温水漱口后品尝酸奶样品。评分标准见表2。

表2 感官评分标准

1.4 数据处理

采用Origin 2018软件对数据进行制图和统计分析，IBM SPSS Statistics 26软件进行显著性分析，Design Expert 12.0软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 3种试验菌株的形态

3株制备Kefir乳的出发菌株见图1。

图1 各发酵菌株菌落形态

2.2 单因素试验

通过感官评分得出A、B、C组的最优添加比例。随着A添加比例的增加，在1∶0.10时感官评分最高，添加量增加到1∶0.25时气泡过多，酒精味过重，杀口感过于刺激，评分最低，见图2中A。随着B添加比例的增加，在1∶0.40时感官评分逐渐上升，在1∶1.00时达到最佳，添加量增大到1∶1.20时感官评分下降，酸奶味道过酸，引起评价人员口感不适，见图2中B。C添加比例为1∶0.05时发酵口感不丰富，酸味不重，无酵母发酵的酒精及气泡带来的杀口感，添加比例增加为1∶0.20时感官评分最高，酸甜适中，气泡带来的杀口感适中，品尝时清爽利口，而添加量增大到1∶0.25时感官评分下降，酸奶杀口感过于浓烈，引起评价人员口感不适，见图2中C。

图2 不同菌种比例组合发酵产品的感官评价

2.3 Box-Behnken设计结果与分析

在考察了A、B、C比例的基础上，在 37 ℃下，白砂糖添加量为2.5 g，接种量为7%，发酵12 h，采用Design Expert 12.0软件设计三因素三水平的响应面试验并进行分析，结果见表3与表4。

表3 响应面试验方案及结果

利用Design Expert 12.0软件，以响应值为感官评分，A(L1∶TN1)、B(L1∶A3)、C(A3∶TN1)为自变量，拟合得到回归方程为：

Y=85.638+0.21125A+0.34875B+0.44C-0.3825AB+0.04AC+0.47BC-2.32775A2-2.09275B2-2.71525C2。

对回归模型进行显著性分析，结果见表4。可以看出，本试验所选模型回归方程P<0.01，模型显著。BC(P<0.05)交互作用达到显著，二次项A2、B2及C2(P<0.01)达到极显著，对发酵乳感官评分有极显著影响。各因素对Kefir感官评分的影响程度为C>B>A。失拟项P>0.05代表模拟函数与真实函数拟合度好，说明此方程可以取得较满意的试验结果。

表4 响应面试验方差分析

2.4 响应面试验的优化及验证试验

控制单个因素不变，分析其他因素的交互作用对感官评分的影响。采用Design Expert 12.0软件处理数据，作出不同组合的两两因素交互的响应面图，见图3。

图3 不同组合之间交互作用对感官评分的影响

响应面优化得到的适宜比例组合A的比例为1∶0.098，B的比例为1∶0.982，C的比例为1∶0.155。将不同菌种组合的优化比例相加得到适宜的L1∶TN1∶A3三菌混合发酵的比例为2.00∶0.25∶1.99。为方便以后企业及家庭的批量使用，建议采用L1∶TN1∶A3为2.0∶0.3∶2.0的比例进行三菌种混合发酵。为验证在优化条件下Kefir口味是否达到最佳，重复3次试验，三菌混合发酵酸奶的感官评分达到87.9分，说明梯次优化菌种比例制备Kefir具有可行性。

2.5 理化指标分析结果

为校验上述优化试验感官分析的实际效果，分别采用L1(单菌)、A组、B组、C组及优化组(L1+TN1+A3)等菌种比例组合按前述培养条件开展对照发酵试验并检测相应理化指标，结果见表5。

表5 不同处理组发酵乳的理化指标比较

由表5可知，发酵终点B组的pH值较低，滴定酸度最高，由于乳酸菌和醋酸杆菌共同发酵，生成乳酸及乙酸量过高。L1发酵组持水率最大，C组乳清析出率最高，基本分析如下：单菌L1组发酵乳持水率显著大于其他发酵组，优化组最低，可能是由于添加酵母菌组发酵乳糖产生的乙醇破坏了酪蛋白网络结构，引起了发酵乳凝胶稳定性下降，持水率降低；而乳清析出是酸奶的一种不良特性，其中C组乳清析出率较大，其次为优化组，可能是由于混菌发酵有机酸种类丰富[23]，从pH、滴定酸度也可以看出，酸度过高更容易接近酪蛋白的等电点，使酸凝固加强，造成乳清析出过多；另外，其他发酵组也有不同的产酸、凝聚及乳清析出现象，表现出不同菌种发酵因产物差异引起凝乳状态发生改变的现象，这一点在前述的感官评定及随后的质构分析及风味成分分析中也可以看出。

2.6 质构分析

将优化组与L1组酸奶进行质构的对比分析，评价指标主要包括：硬度、回弹性、内聚性等方面。L1组酸奶与优化组酸奶的硬度分别为262.64 g 和294.76 g(见表6)。与L1组相比，优化组可显著提高酸奶硬度，相比L1组酸奶硬度提高了12.23%，黏性增加了57.02%，嚼劲增加了33.59%，这可能与蛋白质基质和 TN1、A3之间发生静电相互作用，形成静电复合物，从而产生致密网络有关[24]。此外，优化组显著降低了酸奶的回弹性，与L1组相比，降低了14.74%、内聚性升高了38.10%，弹力增加了75%，由于优化组的硬度较L1组高，对其施加的弹力变大，其回弹性就会降低，恢复到原来形状的能力降低了14.74%。这可能是由于添加醋酸菌使酸奶酸度升高，造成蛋白质内聚性和黏性增强，脱羧化作用对质地及物理特性有负面影响，但综合评价，添加酵母菌及醋酸菌会对改善酸奶风味、增加市场酸奶花色有重大意义。

表6 L1组与优化组对酸乳质构的影响

2.7 挥发性风味物质的比较

采用固相微萃取和气质联用法对优化组混合发酵的Kefir、L1组单菌发酵的酸奶和空白对照牛奶进行挥发性风味物质检测分析，各组样品挥发性物质种类雷达图见图4。

图4 各处理组挥发性物质种类的雷达图

3种乳中检测到的风味物质共有45种，酮醛类化合物7种、酯类14种、醇类6种、酸类12种、烷烃化合物3种及其他类3种。优化组比单菌发酵组增加了13种风味物质，风味物质种类及相对含量见表7。

表7 两种发酵乳与CK组GC-MS风味物质种类及相对含量

检测到的典型的芳香化合物是由牛奶中的主要成分蛋白质、乳糖和脂类通过一系列代谢途径(如脂类分解、蛋白水解和糖酵解)产生[25]。乳酸菌将乳糖分解为单糖，进一步生成乳酸，并为酵母菌和醋酸菌生长提供碳源，促进酒精发酵生成乙醇、CO2、有机酸和醛类等特殊风味物质[26]。优化组主要检测出苯乙烯、水杨酸辛酯、2-甲基丙醇，L(-)-乳酸乙酯、乙酸异戊酯、异戊酸、苯甲酸、辛酸乙酯其他两组不生成的特殊物质。辛酸乙酯和异戊酸是优化组产生的特有的风味物质，增加了酸奶花果香[27]。乳酸乙酯是由乳酸与酵母菌的产物乙醇生成的新产物。苯乙烯可能是在储存期间从包装材料迁移到酸奶中[28]。在酵母菌参与下将乙醛转化为乙酸和乙醇，生成麦芽香气的物质——2-甲基丙醇，赋予Kefir特有的柔和醇香[29]。同时，优化组中的苯乙醇和异戊醇两种高级醇含量较高，分别赋予了Kefir发酵乳制品中典型的玫瑰香气及果香。2-甲基丙醇、苯乙醇和异戊醇3种醇类在普通酸乳中极少检出[30]。2-壬酮、2-庚酮、壬醛、辛酸和乙偶姻等含量显著增多，增加了奶油味。另外，优化组中己醛含量降低，有利于改善奶中的“豆腥味”，证明优化组更加适口，具有传统Kefir粒发酵酸乳而普通酸奶不具备的特殊风味。

3 结论

选择Kefir的主发酵菌种植物乳杆菌L1、酵母菌TN1、醋酸杆菌A3开展单因素试验，得到混菌发酵配比A(L1∶TN1)组比例为1∶0.098、B(L1∶A3)组为1∶0.982、C(A3∶TN1)组为1∶0.155；在此基础上通过响应面试验确定L1∶TN1∶A3三菌混合发酵的适宜比例为2.0∶0.3∶2.0。优化组菌种组合改善了添加酵母菌后发酵乳产气多、有辛辣及杀口感的现象；随后用固相微萃取及气质联用仪对优化组及相关试验组进行了挥发性成分分析，检测到的主要风味物质共有45种，其中异戊醇、苯乙醇、2-甲基丙醇、乳酸乙酯等是Kefir中的关键风味物质，其中己醛含量的减少更是改善了牛奶及普通酸奶的口感。本试验为后续的Kefir 发酵工艺优化及发酵乳中各菌种之间的协同代谢及凝乳结构的变化奠定了基础。