五味子乙素对过敏性哮喘小鼠IL-4/IL-13/STAT6 通路及气道杯状细胞凋亡的影响①

2022-08-30白红丽赵梁育郑速征马志强漯河医学高等专科学校第二附属医院儿科漯河462300

中国免疫学杂志 2022年11期

白红丽赵梁育郑速征马志强（漯河医学高等专科学校第二附属医院儿科，漯河 462300）

哮喘是一种异质性疾病，受遗传和环境因素影响［1］。哮喘患者血清中总免疫球蛋白E（immunoglobulin E，IgE）在接触过敏原后表达升高，则被称为过敏性哮喘［2］。过敏性哮喘是一种复杂的慢性炎症性疾病，其特征为气道炎症、黏液分泌过多和气道重塑。慢性哮喘中的气道炎症是Th2淋巴细胞分泌促炎因子的结果［3］。IL-4、IL-13 和信号转导转录活化因子6（signal transducers and activators of transcription 6，STAT6）是Th2 细胞发育的重要递质［4］。IL-4 和IL-13 是刺激B 细胞产生IgE 和Th2 型分化的重要细胞因子［5］。JAK/STAT 通路中的信号分子STAT6 可被IL-4 和IL-13 激活，在IgE 产生和过敏性气道炎症中发挥重要作用［6］。五味子乙素分离自中药五味子，具有抗氧化、抗内质网应激和抗炎等活性［7］。RAN 等［8］研究发现，五味子乙素可通过抑制核因子-κB 和MAPK 信号通路改善骨关节炎患者炎症反应。但目前关于五味子乙素对过敏性哮喘治疗作用的研究较少。本研究通过构建过敏性哮喘小鼠模型，探究五味子乙素对过敏性哮喘的治疗作用及其对IL-4/IL-13/STAT6 信号通路的影响，为临床应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 6～8 周龄BALB/c 小鼠，体质量约20 g，雌雄各半，购自吉林大学（生物国家级实验教学示范中心），许可证号：SYXK（吉）2018-0015。实验过程符合“3R”原则，遵循实验动物伦理规范。

1.1.2 主要试剂与仪器卵清蛋白（ovalbumin，OVA），纯度≥95%，货号：A8041；五味子乙素标准品，纯度≥98%，货号：SS8230；地塞米松，纯度≥98%，货号：ID0170，均购自北京索莱宝科技有限公司；小鼠IL-4（货号：RAB0300）、IL-13（货号：I1896）、IFN-γ（货号：RAB0225）ELISA 试剂盒购自美国Sigma 公司；TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒（货号：C1091）、HE染色试剂盒（货号：C0105）购自上海碧云天生物科技有限公司；IL-4（货号：12227）、IL-13（货号：85677）、p-STAT6（货号：9361）、β-actin（货号：58169）一抗及二抗（货号：7076）购自美国Cell Signaling 公司；超声雾化器购自江苏鱼跃医疗设备股份有限公司；分析电子天平购自德国Sartorius 公司；酶标仪购自瑞士TECAN 公司；光学显微镜购自日本Nikon 公司；蛋白电泳仪购自北京六一仪器厂；凝胶成像系统购自美国Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 动物分组和建模将BALB/c小鼠随机分为6 组：空白对照组、模型组、五味子乙素低、中、高剂量组和地塞米松组，每组12 只。除空白对照组外，其余各组小鼠分别于第0、7 天腹腔注射致敏液（25 μg 乳化OVA+1 mg 氢氧化铝+200 μl PBS）［9］。第14、15 和16 天采用雾化器雾化吸入1%OVA 生理盐水溶液30 min，对照组给予等量生理盐水雾化。第11 天开始，雾化前30 min，五味子乙素低、中、高剂量组小鼠分别灌胃给予20、30、40 mg/kg五味子乙素［10］，地塞米松组给予灌胃2 mg/kg 地塞米松，空白对照组和模型组灌胃给予等体积生理盐水。最后一次激发24 h 后，各组小鼠随机选取6 只收集支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid，BALF）；另外6 只小鼠完整取出肺脏，计算肺/体质量指数=全肺重量/小鼠体质量，左肺制备匀浆（液氮速冻，-80 ℃保存），右肺进行组织病理学检测。

1.2.2 BALF 采集和炎症因子测定各组随机选取6 只小鼠，处死后打开胸腔，气管插管，1 ml 预冷生理盐水冲洗肺组织3 次，收集BALF，离心，取上清，-80 ℃保存用于ELISA 检测。参照ELISA 试剂盒说明书操作，测定BALF 炎症因子IL-4、IL-13、IFN-γ水平。

1.2.3 HE 染色观察肺组织形态学变化取右肺组织，10%甲醛固定48 h，脱水透明，浸蜡包埋，组织切片。采用HE 染色试剂盒进行染色，中性树胶封片。光学显微镜下观察肺组织形态学变化，并对肺组织进行炎症反应评分［11］。

1.2.4 TUNEL 及PAS 染色检测气道杯状细胞凋亡率石蜡切片脱蜡，梯度乙醇水化，进行TUNEL 实验及PAS 染色，荧光显微镜下观察，每只小鼠随机选取5 张肺组织切片，单盲法随机选取5 支横截面较圆、直径为100～200 μm的支气管，观察拍照，计数杯状细胞总数和凋亡杯状细胞数量，计算杯状细胞凋亡率（%）=凋亡杯状细胞数/杯状细胞总数×100%，取平均值。

1.2.5 小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6 蛋白表达测定取-80 ℃保存的左肺组织，剪碎，加入RIPA 裂解液，匀浆，离心，取上清，BCA 法检测蛋白含量，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜，封闭，加入IL-4、IL-13、p-STAT6、β-actin 一抗（1∶1 000）孵育过夜，清洗，加入HRP 标记的二抗，洗膜，显色发光拍照，Image J分析灰度值。

1.3 统计学分析采用SPSS22.0软件进行统计学分析，计量资料以表示，两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺/体质量指数的影响与空白对照组相比，模型组小鼠肺/体质量指数显著提高（P＜0.05），与模型组相比，五味子乙素各剂量组和地塞米松组小鼠肺/体质量指数显著降低（P＜0.05），其中五味子乙素各剂量组呈剂量依赖性，且五味子乙素高剂量组和地塞米松组差异无统计学意义（P＞0.05，表1）。

表1 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺/体质量指数的影响（±s，n=6）Tab.1 Effect of schisandrin B on lung/body mass index in mice with allergic asthma（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs schisandrin B low dose group；4）P＜0.05 vs schisandrin B medium dose group.

Groups Blank control Model Schisandrin B low dose Schisandrin B medium dose Schisandrin B high dose Dexamethasone Lung/body mass index/%1.34±0.11 2.27±0.151）1.83±0.102）1.62±0.122）3）1.42±0.092）3）4）1.39±0.072）3）4）

2.2 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠BALF 细胞因子的影响如表2所示，与空白对照组相比，模型组小鼠BALF 中IL-4、IL-13 水平显著升高（P＜0.05），IFN-γ 水平显著降低（P＜0.05）；与模型组相比，五味子乙素各剂量组和地塞米松组小鼠BALF 中IL-4、IL-13 水平显著降低（P＜0.05），IFN-γ 水平显著升高（P＜0.05），且呈剂量依赖性，五味子乙素高剂量组和地塞米松组差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠BALF中细胞因子水平的影响（±s，n=6，ng/L）Tab.2 Effect of schisandrin B on cytokines levels in BALF of allergic asthma mice（±s，n=6，ng/L）

Note：1）P＜0.05 vs blank control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs schisandrin B low dose group；4）P＜0.05 vs schisandrin B medium dose group.

Groups Blank control Model Schisandrin B low dose Schisandrin B medium dose Schisandrin B high dose Dexamethasone IL-4 53.74±5.82 96.36±8.181）85.65±7.432）71.26±5.972）3）58.67±6.052）3）4）57.25±4.842）3）4）IL-13 14.38±1.46 79.25±4.481）62.35±3.572）41.36±3.122）3）22.98±2.672）3）4）19.27±1.812）3）4）IFN-γ 482.19±27.04 212.54±19.181）293.82±15.542）375.43±21.272）3）452.59±16.352）3）4）463.71±28.492）3）4）

2.3 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺组织病理学及炎症反应评分的影响空白对照组小鼠肺组织结构基本正常；模型组小鼠肺组织结构损伤严重，肺泡壁增厚，血管周围水肿明显，肺泡腔内和支气管周围有大量炎症细胞浸润，管腔内有大量分泌物；五味子乙素各剂量组和地塞米松组肺组织结构较完整，水肿程度减轻，分泌物减少，炎症细胞浸润减少，且随着五味子乙素剂量增大，病变程度逐渐减轻。与空白对照组比较，模型组小鼠肺组织炎症反应评分显著升高（P＜0.05）；与模型组比较，五味子乙素低、中、高剂量组肺组织炎症反应评分依次降低（P＜0.05）。地塞米松组小鼠肺组织病理学变化与五味子乙素高剂量组差异无统计学意义（P＞0.05，图1、表3）。

表3 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺组织炎症反应评分的影响（±s，n=6）Tab.3 Effect of schisandrin B on lung inflammation score in mice with allergic asthma（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs schisandrin B low dose group；4）P＜0.05 vs schisandrin B medium dose group.

Groups Blank control Model Schisandrin B low dose Schisandrin B medium dose Schisandrin B high dose Dexamethasone group Inflammatory response score 0.14±0.02 3.76±0.371）2.83±0.292）2.01±0.222）3）1.18±0.152）3）4）0.75±0.132）3）4）

图1 各组小鼠肺组织HE染色（×200）Fig.1 HE staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.4 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠气道杯状细胞凋亡率的影响与空白对照组相比，模型组小鼠气道杯状细胞凋亡率显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，五味子乙素各剂量组和地塞米松组小鼠气道杯状细胞凋亡率显著降低（P＜0.05），且呈剂量依赖性，五味子乙素高剂量组和地塞米松组差异无统计学意义（P＞0.05，图2、表4）。

表4 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠气道杯状细胞凋亡率的影响（±s，n=6）Tab.4 Effect of schisandrin B on apoptosis rate of airway goblet cells in mice with allergic asthma（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs schisandrin B low dose group；4）P＜0.05 vs schisandrin B medium dose group.

Groups Blank control Model Schisandrin B low dose Schisandrin B medium dose Schisandrin B high dose Dexamethasone Apoptosis rate of goblet cells in airway/%2.32±0.71 57.89±3.941）36.15±2.582）12.96±2.172）3）5.74±1.102）3）4）4.98±1.232）3）4）

图2 各组小鼠肺组织TUNEL染色（×200）Fig.2 TUNEL staining of lung tissue of mice in each group（×200）

2.5 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6 蛋白表达的影响与空白对照组相比，模型组小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6 蛋白表达显著增加（P＜0.05）。与模型组相比，五味子乙素各剂量组和地塞米松组小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6蛋白表达显著降低（P＜0.05，且呈剂量依赖性，五味子乙素高剂量组和地塞米松组差异无统计学意义（P＞0.05，图3、表5）。

图3 Western blot 检测过敏性哮喘小鼠肺组织IL-4、IL-13、p-STAT6蛋白表达Fig.3 Western blot to detect IL-4，IL-13 and p-STAT6 protein expressions in lung tissue of allergic asthma mice

表5 五味子乙素对过敏性哮喘小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6蛋白表达的影响（±s，n=6）Tab.5 Effect of schisandrin B on protein expressions of IL-4，IL-13 and p-STAT6 in lung tissue of allergic asthma mice（±s，n=6）

Note：1）P＜0.05 vs blank control group；2）P＜0.05 vs model group；3）P＜0.05 vs schisandrin B low dose group；4）P＜0.05 vs schisandrin B medium dose group.

Groups Blank control Model Schisandrin B low dose Schisandrin B medium dose Schisandrin B high dose Dexamethasone IL-4/β-actin 0.14±0.03 1.03±0.121）0.88±0.092）0.57±0.062）3）0.21±0.042）3）4）0.18±0.052）3）4）IL-13/β-actin 0.13±0.07 1.12±0.201）0.89±0.152）0.51±0.112）3）0.24±0.082）3）4）0.20±0.052）3）4）p-STAT6/β-actin 0.11±0.04 1.05±0.171）0.78±0.192）0.46±0.152）3）0.19±0.072）3）4）0.14±0.062）3）4）

3 讨论

过敏性哮喘是一种慢性呼吸道炎症性疾病，患者接触过敏原后会导致呼吸困难、气道高反应性、喘息和咳嗽间歇发作，临床特征为气道高反应性、黏液过度产生和慢性嗜酸性炎症反应［9，12］。研究发现，过敏性哮喘小鼠体内气道杯状细胞增多可导致黏液分泌增加并累积，影响呼气容积［13］。本研究通过OVA 致敏与激发建立小鼠过敏性哮喘模型，结果显示小鼠肺组织结构损伤严重，肺泡壁增厚，肺泡腔内和支气管周围有大量炎症细胞浸润，肺/体质量指数、气道杯状细胞凋亡率、BALF 中IL-4、IL-13 水平显著升高，IFN-γ 水平显著降低，提示小鼠过敏性哮喘模型构建成功。

五味子首载于《神农本草经》，属于滋补性中药，五味子乙素是其主要活性成分之一。大量研究发现，五味子乙素具有明显抗炎作用，如在脓毒症小鼠模型中，五味子乙素可下调LPS 诱导的巨噬细胞中TLR4 表达，降低IL-1β 和TNF-α 产生及释放，减轻炎症反应［14］。MOU 等［15］发现，五味子乙素可通过抑制炎症反应和氧化应激治疗糖尿病肾病小鼠，减轻肾组织氧化应激及炎症损伤。本研究在五味子乙素作用下，过敏性哮喘小鼠肺组织病变程度减轻，炎症细胞浸润减少，肺/体质量指数、气道杯状细胞凋亡率、BALF 中IL-4、IL-13 水平显著降低，IFN-γ水平显著升高，且呈剂量依赖性，表明五味子乙素可减轻过敏性哮喘小鼠炎症反应，保护肺组织结构。王定荣等［10］研究发现，五味子乙素可降低哮喘小鼠炎症反应，保护肺组织结构，与本研究结论一致。

在过敏性哮喘中，Th2 细胞产生细胞因子（如IL-13），这些细胞因子通过刺激B 细胞产生IgE，引起炎症细胞浸润而发挥关键作用［9］。本研究中，过敏性哮喘小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6蛋白表达显著升高，说明IL-4 与IL-13 表达增加，进一步激活STAT6 磷酸化，使T 细胞向Th2 分化，导致免疫失衡，促进过敏性哮喘小鼠炎症反应。研究发现，麻黄细辛附子汤对过敏性鼻炎的治疗作用可能通过抑制IL-4/STAT6通路减轻变应性炎症反应［16］。通过降低IL-4/IL-13/STAT6信号通路活化，布地奈德亦可改善变应性鼻炎大鼠鼻黏膜症状［17］。本研究中，经五味子乙素处理后，过敏性哮喘小鼠肺组织中IL-4、IL-13、p-STAT6蛋白表达显著降低，且呈剂量依赖关系，推测五味子乙素亦可通过抑制IL-4/IL-13/STAT6 信号通路活化降低过敏性哮喘小鼠炎症反应。

综上所述，五味子乙素对过敏性哮喘小鼠具有明显治疗作用，可能通过减少IL-4、IL-13 分泌，抑制STAT6磷酸化，缓解小鼠肺组织的炎症反应，减轻肺组织病理损伤。本研究证实IL-4/IL-13/STAT6 信号通路是过敏性哮喘发生、发展的重要信号通路，为过敏性哮喘治疗提供了参考。