基于分子互作网络探讨丹蒌片干预PI3K/AKT/NF-κB/TNF 通路防治非酒精性脂肪肝病的机制

张 新 陈文娜 宋 囡 金宏飞 张 琪 何信用 刘雨彤 （辽宁中医药大学，沈阳 110000）

非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）是指除酒精和其他明确肝脏损伤因素外，以肝细胞脂肪过度堆积、脂肪变性、炎症细胞浸润为主要特征的临床综合征，其发生发展与胰岛素抵抗、氧化应激、炎症反应等密切相关［1-2］。历代医家根据其临床表现将其称为“胁痛”“痰浊”“积聚”“肥气”“肝癖”等［3］。近年全球流行病学调查研究显示，NAFLD 在全球范围的发病率为10%～30%，在中国的患病率约为15%，且逐步呈现年轻化趋势［4-5］。目前临床上多使用降脂药物、抗氧化剂和胰岛素增敏剂等进行治疗，但长期服用这些药物可能引发严重的毒副作用［6］。相对而言，中医在治疗NAFLD 方面具有其独特的优势，使得一些中草药成为治疗NAFLD的理想药物［7］。

丹蒌片主要由瓜蒌、薤白、川芎、丹参、葛根、赤芍、泽泻、郁金、骨碎补、黄芪10 味中药组成，以化瘀散结、益气通阳功效组方。方中泽泻、葛根、黄芪有保护血管内皮细胞抗氧化应激损伤作用［8-10］；瓜蒌、骨碎补、郁金、薤白有抗动脉粥样硬化和降脂等作用［11-12］；川芎、丹参、赤芍有降低血液黏度及毛细血管通透性、改善血液流变等作用［13］；同时，丹蒌片集宣痹、通滞、化痰、养血、化瘀、理气于一体，进而从多角度对NAFLD 进行治疗。

本课题组传承杨关林教授“痰瘀论治”动脉粥样硬化性疾病学术思想，循证证实“化瘀祛痰”干预冠心病稳定型心绞痛具有提高运动耐量、减少心绞痛发作的作用，并具有良好滞后效应（18 周）临床价值。该法已被公认为治疗冠心病的新方法，被“十二五”“十三五”行业规划教材《中医内科学》及《中西医结合内科学》采纳；开创“痰瘀论治”研究新流派。代表药物丹蒌片（国药准字Z20050244）为吉林康乃尔药业有限公司独家拥有的新药，是医保、中保品种，被4 个指南或专家共识推荐应用。丹蒌片自上市临床应用以来已被大量试验研究证实对痰瘀互结型疾病疗效显著，可改善该类患者的临床症状，其安全性好，可减少心肌耗氧量，且不良反应少，现已在临床上广泛推广使用［14-17］。但丹蒌片通过干预PI3K/AKT/NF-κB/TNF通路防治NAFLD 的机制在既往研究中鲜有报道，需要利用动物实验以探索其机制。故本研究通过构建多维分子互作网络，并应用动物实验对中药分子靶标进行验证，从而为丹蒌片治疗NAFLD的作用机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 数据库及在线软件 PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）、TCMSP 数据库（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）、PharmMapper 数据库（http：//lilab-ecust.cn/pharmmapper/）、TTD 数据库（https：//db.idrblab.org/ttd/）、DisGeNET 数 据 库（http：//www.disgenet.org/）、Uniprot 数据库（https：//www.uniprot.org/）、String 数据库（https：//string-db.org）、Gene Cards 数 据 库、（https：//www.genecards.org/）、Cytoscape 3.7.1软件、Venny2.1软件［18-24］。

1.1.2 试剂与仪器 丹蒌片（吉林康乃尔药业有限公司）；总胆固醇（total cholesterol，TC）、三酰甘油（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固醇（low-density lipoprotein cholesterol，LDL-C）和高密度脂蛋白胆固醇（high-density lipoprotein cholesterol，HDL-C）测定试剂盒（四川迈克生物科技股份有限公司）；TNF-α、IL-6 检测试剂盒（武汉伊莱瑞特生物科技股份有限公司）；肿瘤坏死因子受体相关因子2（tumor necrosis factor receptor-associated factors 2，TRAF2）、PI3K、p-AKT、NF-κB 抗体（武汉三鹰生物技术有限公司）；p-IκBa、p-IKKs 抗体（Abcam 公司）；Tanon 5200 化学发光成像系统（上海天能科技有限公司）；AU5800全自动生化分析仪（美国贝克曼库尔特公司）、Tecan Infinite M1000 PRO 多功能酶标仪（瑞士Tecan公司），全自动蛋白质印迹定量分析系统（普诺森生物科技有限公司）。

1.1.3 实验动物 SPF级C57BL/6J 雄性小鼠18只，8 周龄，体质量18～22 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证号为SCXK（京）2012-0001，饲养于全封闭SPF 级状态下的辽宁中医药大学实验动物中心，保证动物自由进食与饮水。动物实验经辽宁中医药大学动物伦理委员会批准，并按照《实验动物饲养管理和使用指南》进行。

1.2 方法

1.2.1 丹蒌片化学成分的查找 通过TCMSP 数据库对丹蒌片全方，即丹参、瓜蒌、川芎、骨碎补、郁金、赤芍、泽泻、薤白、葛根、黄芪10 味中药进行检索，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%和类药性（drug likeness，DL）≥0.18 为条件进行筛选。另外，查阅文献找到丹蒌片中因上述筛选条件而被剔除但对NAFLD 有潜在研究价值的药物成分，删除无靶点的活性成分，筛选得到有效药物成分。

1.2.2 丹蒌片靶点的筛选及网络构建 通过Pub-Chem 数据库、TCMSP 数据库、PharmMapper 数据库查找丹蒌片所有潜在的药物作用靶点，同时利用Uniprot 数据库，将蛋白种属设置为“Homo sapiens（Human）”，校正收集的靶点，同时利用Cytoscape 3.7.1软件构建药物-活性成分-靶点网络图。

1.2.3 NAFLD 靶点的筛选 以“non-alcoholic fatty liver disease”为检索词，通过DisGeNET 数据库、Gene cards 数据库、TTD 数据库进行检索，依据不同数据库筛选条件，将结果分类并删除重复数据，获取NAFLD 的潜在靶点数据集，并利用Uniprot 数据库校正获取标准基因名。

1.2.4 药物疾病共有靶点网络的构建及映射 将药物靶点和疾病靶点分别上传至Venny2.1 软件绘制韦恩图，取丹蒌片与NAFLD 靶点交集，将共有靶点以数据文件和属性文件上传入至Cytoscape3.7.1软件，点击“Tools-NetworkAnalyzer-Network Analysis-Analyze Network”，同时成分和基因按照Degree 排列，利用网络节点相关拓扑参数构建共有靶点网络。

1.2.5 PPI 网络分析 将上述靶点导入STRING 平台，蛋白种属设置为“Home sapiens”，选择“multiple proteins”模式，最低相互作用阈值选择“highest confidence（≥0.700）”，network display mode 选择“interactive svg”，network display options 选择“hide disconnected nodes in the network”，其余参数默认，建立药物-疾病靶标PPI相互作用网络。

1.2.6 GO功能富集分析及KEGG通路富集分析将上述筛选出的PPI 网络靶点输入DAVID6.8 数据库，选择“OFFICE_GENE_SYMBOL”“gene list”“Homo sapiens”，然后导出Gene Ontology 的BP、CC、MF及Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 中的PATHWAY 进行GO 基因注释及KEGG 通路分析。按P值（P≤0.01）升序排列，利用Excel 文件及Omic Share云平台将符合条件的GO 生物过程和KEGG 信号通路进行数据可视化分析。

1.2.7 动物分组及造模 C57BL/6J小鼠18只随机分为对照组、模型组和丹蒌片组，6 只/组，对照组给予正常饲料喂养，模型组与丹蒌片组给予高脂饲料8周造模，8周后丹蒌片组给药［680 mg（/kg·d）］4周，剂量按人与动物体表面积折算系数换算，同时对照组与模型组灌胃4周等体积生理盐水。

1.2.8 血脂水平检测 眼球采血法收集小鼠血液，3 500 r/min 离心30 min后，采用全自动生化分析仪，按照试剂说明步操作检测血清血脂LDL-C、HDL-C、TC、TG水平，最后对数据进行统计分析。

1.2.9 全自动蛋白质印迹定量分析系统（Wes）检测TNF 通路相关蛋白表达 打开Wes 仪器、电脑及Compass 软件进行自检。利用RIPA 蛋白裂解液（含蛋白酶抑制剂）提取肝组织蛋白，BCA 试剂盒检测蛋白浓度，使用Antibody Diluent Ⅱ稀释一抗和二抗，样品上样量为4.5 μl，包括0.1×Sample Buffer 与样品原液共3.6 μl，5×Master Mix 0.9 μl，95 ℃变性5 min。样品制备后，按照样品、封闭液、一抗、二抗、发光液及洗液顺序加入孔板，上机检测结束后对结果进行分析处理。

1.3 统计学分析 采用Graphpad Prime 8 软件进行统计分析，计量数据均以表示。两组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 丹蒌片活性成分 利用TCMSP 数据库检索丹蒌片10味中药，即：丹参、瓜蒌、川芎、骨碎补、郁金、赤芍、泽泻、薤白、葛根、黄芪，共检索得到190 个活性成分，删除重复成分及无效成分后，得到141个有效活性成分，具体见图1（由于图中部分成分名称过长不易展示，具体见表1）。

表1 丹蒌片部分活性成分Tab.1 Some effective active ingredients in Danlou Tablets

2.2 丹蒌片靶点的筛选及网络构建 利用Pub-Chem、TCMSP、PharmMapper 数据库筛选丹蒌片所有潜在的药物作用靶点，并通过Uniprot 数据库校正，去重后共得到350 个潜在靶点，Cytoscape 3.7.2软件根据degree 值构建药物-活性成分-靶点网络，degree 值越大代表药物靶点作用力越强。其中青色代表药物作用靶点，其他颜色代表药物活性成分（未删除重复项），见附图1（www.immune99.com）。

图1 丹蒌片成分网络Fig.1 Ingredient network of Danlou Tablets

2.3 疾病靶点的筛选 通过DisGeNET、Gene cards、TTD 数据库进行检索，以“non-alcoholic fatty liver disease”为检索词，计算Gene cards 数据库相关性（relevance score）的两次中位数为13.41，筛选出Relevance score≥13.41 的数据403 个，DisGeNET 数据库中筛选出Score_gda≥0.1 的数据140 个，TTD 数据库中筛选出3 个，去重并利用Uniprot 数据库校正后共得到478 个与NAFLD 相关的潜在疾病靶点，主要包括载脂蛋白B（apolipoprotein B，ApoB）、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）、磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphatidylinositol 3 kinase，PI3K）、前列腺素G/H 合成酶2（prostaglandin-endoperoxide synthase 2，PTGS2）、AKT 丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶1（AKT serine/threonine kinase 1，AKT1）等，如图3。

图3 药物靶点-疾病靶点韦恩图Fig.3 Venn diagram of targets of herbs and disease

图2 疾病靶点网络Fig.2 Ingredient network of disease

2.4 药物疾病共有靶点网络构建及映射 将上述丹蒌片及NAFLD 靶点依次上传至Venny2.1 软件，绘制韦恩图，得到共有靶点115个，其中蓝色代表疾病靶点，黄色代表药物靶点，见图4。主要涉及过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptor gamma，PPARG）、核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）、IL-6、IκB 激酶家族（IκB kinases，IKKs）、沉默调节蛋白1（sirtuin 1，SIRT1）、诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）等。然后将相互作用的蛋白基因导入Cytoscape 3.7.1 软件进行可视化分析，共得到2 191 条边，115个节点，聚类系数为0.679，见图5。

图4 共有靶点网络Fig.4 Network of common targets

图5 共有靶点PPI网络Fig.5 PPI network of common targets

2.5 PPI 网络的构建 为进一步明确丹蒌片潜在靶点与NAFLD靶点间的相互作用关系，将上述筛选得到的共有靶基因上传至STRING 平台获得PPI 网络，共得到边数955 条，平均节点度值为16.6，平均本地聚类系数为0.536，见图6。

图6 KEGG信号通路结果Fig.6 Results of KEGG signaling pathway

2.6 GO 生物过程和KEGG 通路富集分析 将共有核心靶基因上传至DAVID 6.8数据库进行KEGG信号通路的富集及GO 基因注释分析，共得到P＜0.01的KEGG 信号通路93 个，按照P值升序排列筛选出前20 条与NAFLD 相关的通路，主要包括：非酒精性脂肪肝疾病通路、FoxO 信号通路、TNF 信号通路，HIF-1 信号通路、Toll 样受体信号通路等；然后将上述通路上传至OmicShare 平台，进行数据可视化分析，气泡颜色代表富集显著性，大小代表与NAFLD相关且参与该通路的基因数目，见图7；同时得到335 个生物学过程，主要包括炎症反应、一氧化氮生物合成的正调控、细胞对脂多糖的应答、蛋白质磷酸化的正调控、胆固醇代谢过程、胰岛素刺激的细胞反应等；47 个分子生物学功能，主要包括生长因子活性、血红素结合、氧化还原酶活性、脂质结合等；32 个细胞组分，主要包括细胞外空间、膜筏、细胞质核周区域、受体复合物等，见图8；进一步对GO生物过程和KEGG 通路按照P值筛选分析，发现TNF 炎症通路中的PI3K/p-AKT/p-IKKs/NF-κB 通路密切参与NAFLD的发生发展，见图9。

图7 丹蒌片调控NAFLD的GO生物过程分析Fig.7 GO biological process analysis of NAFLD regulated by Danlou tablets

图8 TNF通路过程分析Fig.8 TNF pathway process analysis

图9 各组小鼠血脂水平Fig.9 Blood lipid levels in each group of mice

2.7 各组小鼠血脂水平比较 与正常组相比，模型组小鼠血清LDL-C、TG和TC水平显著升高，HDL-C水平降低（P＜0.05）；丹蒌片组干预后可明显降低模型组小鼠血清LDL-C、TG 和TC 水平，升高HDL-C 水平（P＜0.05），见图10。

图10 TNF通路蛋白表达水平Fig.10 Expression levels of TNF pathway proteins

2.8 TNF通路蛋白表达情况 与对照组相比，模型组小鼠肝组织PI3K、p-AKT、p-IκBa蛋白表达水平明显降低，TRAF2、p-IKKs、NF-κB 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05）；丹蒌片干预后PI3K、p-AKT、p-IκBa蛋白表达水平呈上升趋势，TRAF2、p-IKKs、NF-κB蛋白表达水平呈现下降趋势（P＜0.05），见图11。

图11 炎症因子表达水平Fig.11 Expression levels of inflammatory factors

2.9 各组小鼠肝组织TNF-α、IL-6 的表达情况 模型组肝组织TNF-α、IL-6 炎症因子表达水平与正常组相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05），丹蒌片干预后TNF-α、IL-6 炎症因子表达水平显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），见图12。

3 讨论

NAFLD 是一种与遗传易感和胰岛素抵抗密切相关的代谢应激性疾病，主要以肝细胞弥漫性脂肪变为特征，中医将NAFLD 归属于“肝癖”“胁痛”“肥气”“积证”等病证范畴，曾有人在《难经》描述NAFLD：“肝之积，名曰肥气，在左胁下”［25］。刘中勇认为，食肥甘厚腻之物过剩，滋腻碍胃，脾失健运，水谷精微运化失调，疏泄失常，湿浊内生，聚湿成瘀浊，阻其血脉，血液运行不畅，瘀结于肝，属本虚标实之证［26］。而丹蒌片即为针对痰瘀互结型疾病的一种中成药，薤白、瓜蒌皮化痰散结为君药，赤芍、丹参、川芎、郁金活血化瘀；黄芪可补气，葛根助黄芪之力，皆使气助血行化瘀，亦为臣药；骨碎补、泽泻、葛根皆为佐药，郁金、川芎、丹参皆有引经报使的功效，君、臣、佐、使结合，达到攻补兼施，共奏血脉和畅，痰消瘀化，痹宜痛止，标本兼治的目的［27］。

本研究通过网络药理学方法发现，丹蒌片可能通过多过程、多通路对NAFLD 发挥调控作用。GO基因注释分析主要涉及的生物过程包括一氧化氮生物合成的正调控、胆固醇代谢过程、炎症反应、胰岛素刺激的细胞反应、生长因子活性、血红素结合、氧化还原酶活性、脂质结合等；KEGG 通路分析主要涉及FoxO 信号通路、TNF 信号通路、HIF-1 信号通路、Toll样受体信号通路等，本研究发现PI3K、AKT、IKKs、NF-κB 等基因主要富集于TNF 信号通路，而TNF 信号主要调控免疫炎症反应，下调其表达可抑制脂肪合成和炎症反应，降低胰岛素敏感性，进而改善NAFLD 临床症状［28-30］。同时，张志强等［31］发现丹蒌片不仅能降低IL-6、TNF-α 等炎症因子水平，同时可以下调MDA 水平、上调SOD 水平，有效减轻肝组织氧化应激损伤程度，抑制NAFLD 的进程。此外，FoxO、HIF-1、Toll样受体等信号通路也多与氧化应激、炎症反应等过程相关［32-35］，故推测丹蒌片通过多过程、多通路共同参与抑制炎症反应、氧化应激等过程进而发挥抗NAFLD作用。

NAFLD 的发病机制尚不明确，普遍认为其发病机制与“两次打击”学说相关［36］。而“第二次打击”主要是指脂肪变性引起细胞内代谢紊乱导致肝细胞损伤和炎症反应，引起NAFLD 进一步恶化［37］。TRAF2 作为TNF 通路的衔接蛋白，主要激活转录因子c-Jun氨基末端激酶信号通路和NF-κB信号通路，参与免疫细胞的调节［38］。NF-κB 是一种转录因子，在炎症进展中发挥核心作用。正常情况下，NF-κB蛋白通过与IκBα蛋白相互作用，以非活性状态存在于细胞质中。NF-κB 的激活主要通过抑制IKKs 对IκBα 的磷酸化和蛋白酶体的降解，导致NF-κB 的核转位［39］。调节一系列炎症相关介质如TNF-α、IL-6的转录和合成，可诱发机体产生级联瀑布式炎症反应［40-41］。AKT 是一种丝氨酸苏氨酸激酶，是信号传导通路下游重要的靶激酶，通过PI3K的磷酸化调控后进一步使其下游信号传导细胞因子IKKs 磷酸化［42］。IKK 属于丝/苏氨酸蛋白激酶复合体，一般情况下，NF-κB 与IκB 结合存在于胞质中，炎症等因素能刺激IKK 活化，活化的IKK 可通过泛素化或磷酸化激活IκB，使之与NF-κB 解离［43］。本课题组研究发现，丹蒌片干预后，模型组PI3K、p-AKT、p-IκBα蛋白表达水平呈上升趋势，TRAF2、p-IKKs、NF-κB蛋白表达水平呈下降趋势，同时血脂水平明显下降，炎症因子TNF-α、IL-6 水平显著下降，提示丹蒌片可能通过炎症通路途径降低血脂水平，进而抑制NAFLD的发生发展。

本研究利用分子互作网络，预测丹蒌片潜在活性成分作用于NAFLD 的潜在分子机制，结果显示丹蒌片通过抗炎、调控氧化应激反应、调节脂质代谢等多成分、多通路地发挥抗NAFLD 作用。同时课题组应用动物实验对中药分子靶标进一步验证，研究发现炎症反应促进NAFLD 的发生发展，为丹蒌片的临床应用及NAFLD 的临床研究提供一定的参考价值。