原发性肝癌患者外周效应功能T细胞的保护意义①

臧超然 覃 岭 刘桂海 孙坚萍 李 康 张永宏

（首都医科大学附属北京佑安医院生物医学信息中心，北京 100069）

原发性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是肝脏最常见的恶性肿瘤，全球新诊断的HCC 病例和病死患者约有50%发生在我国［1］。目前HCC 的治疗方案包括外科切除、肝脏移植、消融治疗、经导管动脉栓塞、靶向治疗、免疫治疗等［2］。因为HCC发病隐匿，多数患者在确诊时已进展至中晚期而失去根治机会［3］。免疫治疗的兴起给很多患者带来希望。但由于目前关于肿瘤发生发展免疫机制的不明确以及免疫治疗相关研究的欠缺等，免疫治疗的疗效仍不尽人意，其机制有待深入研究［4-5］。

肿瘤发生过程中，T细胞发挥主要清除作用。肿瘤细胞与T 细胞相互作用影响HCC 的发展方向［6］。在免疫系统的监视作用下，肿瘤细胞通过各种机制影响T 细胞的生存及命运从而获得生存机会。因此，确定肿瘤特异性T 细胞并使该T 细胞发挥杀伤功能是控制肿瘤的关键所在。据此，课题组筛选并使用了5 种在HCC 中表达的肿瘤相关抗原（tumorassociated-antigen，TAA）——婆罗双树样基因-4（SALL4）、黑色素瘤抗原A1（MAGE-A1）、MAGE-A3、纽约食管鳞状上皮癌抗原1（NY-ESO-1）、滑膜肉瘤X 断裂点2（SSX-2）组成抗原肽库，检测HCC 患者外周血中TAA 特异性T 细胞免疫反应，分析不同HCC患者间T 细胞的差异，并结合疾病预后分析T 细胞对疾病进展的影响。

1 资料与方法

1.1 资料

1.1.1 一般资料 本研究纳入原发性肝癌患者39例，男31例，女8例，平均年龄（55.26±1.31）岁，参照美国肝病研究协会（AASLD）的诊断标准诊断［2］，患者均未接受免疫相关治疗。患者均采用介入治疗并随访，每3~6 个月行CT 检查，如发现肝脏或其他部位出现新发肝癌病灶，则诊断为治疗后复发。

1.1.2 主要试剂 RPMI1640 培养基购自美国Hyclone 公司；96 孔反应板购自美国 Millipore 公司；酶联免疫斑点测定（enzyme-linked immunospot assay，ELISPOT）试剂盒购自瑞典 Mabtech 公司；CD3 抗体（克隆：SK7）、PD1 抗体（克隆：EH12.2H7）购自美国Biolegend 公司；CD4 抗体（克隆：M-T477）、CD8 抗体（克隆：SK1）、CD45RA 抗体（克隆：HI100）、CCR7 抗体（克隆：150503）、CD27 抗体（克隆：M-T271）、CD152抗体（克隆：BNI3）购自美国BD公司。

1.2 方法

1.2.1 肽库的合成 以蛋白文库中SALL4、SSX2、MAGE-A1、MAGE-A3、NY-ESO-1 蛋白序列为模板，合成18 个氨基酸长、10 个氨基酸重叠的多肽片段259 条，并制成7 个反应肽库，各肽库所包含的肽段如表1所示。

表1 7个肽库的肽段序列Tab.1 Peptide sequences of seven peptide pools

1.2.2 外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的分离 以EDTA抗凝管留取肝癌患者外周血，采用密度梯度离心法分离得到PBMC［7］，取适量用于 ELISPOT 实验，剩余细胞冻存于液氮中。

1.2.3 ELISPOT 上述采用密度梯度离心法分离得到的PBMC 经计数后，采用TAA 肽库刺激，检验IFN-γ 分泌情况。试剂采用 IFN-γ 酶联斑点免疫分析试剂盒，数据处理采用ELISPOT 酶联斑点分析系统，阳性判断标准为每孔斑点数-背景斑点数≥25个且＞2 倍的背景斑点数，结果采用单位斑点形成数/106单个核细胞（SFU/106PBMC）表示。

1.2.4 流式细胞术 将冻存的PBMC 复苏，收集约1×106个细胞，以100 μl PBS 重悬。根据抗体说明书要求加入适量荧光标记抗体，4 ℃避光孵育20 min。PBS 洗涤 2 次，重悬于 500 μl 细胞固定液中用于流式细胞仪分析。

1.3 统计学处理 应用SPSS21.0 统计软件，符合正态分布的数据以表示，两组间计量资料比较采用独立样本t检验；非正态分布的数据以中位数［M（Q1，Q3）］表示，采用秩和检验。治疗后生存分析采用Kaplan-Meier Log-rank检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 HCC 患者TAA 特异性T 细胞免疫反应 入组患者中有17例对任何TAA 均未出现特异性T 细胞免疫反应，阴性反应率为43.59%（17/39），22例患者的PBMC 至少能识别其中1 种TAA，阳性反应率为56.41%（22/39）。就目前所覆盖的肿瘤相关抗原，仅有约半数患者的外周循环中存在特异性T细胞。

2.2 TAA 特异性T 细胞免疫反应不同患者间的预后分析 所有HCC 患者根据不同病情均接受介入治疗，其中接受消融治疗并达到完全消融目的的患者有27例。对达到完全消融目的的患者进行随访，随访时间为0~32 个月，随访CT 发现新发灶为随访终点。生存分析显示，TAA 特异性T 细胞反应阳性患者的无复发生存期优于TAA特异性T细胞反应阴性患者，差异有统计学意义（P＜0.01，图1）。

图1 TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性和阴性患者的生存分析Fig.1 Survival analysis of patients with positive and negative TAA-specific T cell immune response

2.3 不同TAA 特异性T 细胞免疫反应患者间T 细胞分化表型的差异 对外周血T 细胞的分化表型进行分析，结果显示：TAA特异性T细胞免疫反应阳性患者外周血中CD4+和CD8+的TTE（terminal effector T cell，CD27-CD45RA+CCR7-）细胞百分比高于TAA 特异性T 细胞反应阴性患者［CD4：0.83%（0.34%，1.33%）vs0.36%（0.24%，0.58%），P=0.02；CD8：7.57%（3.46%，11.29%）vs4.76%（2.42%，6.77%），P=0.03］，且TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性患者的CD4+TEM（effector memory T cell，CD27-CD45RA-CCR7-）显著高于阴性患者［8.94%（6.30%，16.56%）vs6.32%（4.38%，11.77%），P=0.04］（图2）。提示该部分患者中效应阶段T细胞水平较高，有利于针对并及时消灭靶细胞。

图2 TAA特异性T细胞免疫反应阳性和阴性患者的T细胞分化表型分析Fig.2 Differentiation phenotypic analysis of T cells in patients with and without TAA-specific T cell immune response

2.4 TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性患者免疫检查点水平的表达差异 在外周循环能够检测到TAA 特异性 T 细胞的 22例 HCC 患者中，疾病早期（BCLC-0/A）患者 14例，进展期（BCLC-B/C）患者8例。对这 22例患者 PBMC 的免疫检查点 PD-1 和CD152 表达水平进行分析，结果显示：早期患者的CD8+PD1+T 细胞百分比为（27.66±2.64）%，进展期患者的CD8+PD1+T 细胞百分比为（40.65±4.39）%，两组间差异有统计学意义（t=2.71，P=0.01）；早期患者的 CD8+CD152+T 细胞百分比为（11.84±0.89）%，进展期患者的CD8+CD152+T细胞百分比为（17.96±1.72）%，两组间差异有统计学意义（t=3.51，P＜0.01，图3）。早期和进展期患者间CD4+T细胞比例未见明显差异。提示进展期患者的耗竭性细胞毒性T细胞比例显著增高。

图3 TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性的早期和进展期HCC患者耗竭性CD8+T细胞水平的比较Fig.3 Comparison of exhausted CD8+T cell levels in early and advanced HCC patients with positive TAA-specific T cell immune response

3 讨论

近年来，肿瘤免疫学相关研究取得了重大进展，许多免疫治疗方法已被应用于临床，尤其是各种致力于改善和恢复 T 细胞功能的免疫疗法［4-5，8-10］。肿瘤进展的相关免疫学机制也在被一步步深入探索并逐渐揭示。但我国HCC 人群T 细胞特点的数据较少，限制了基于我国人群的肝癌免疫治疗发展［11-12］。

T 细胞是肿瘤发生发展过程中负责消灭恶性细胞的主要力量。T 细胞识别并消灭肿瘤细胞的过程称为“肿瘤免疫循环”［13］，但由于肿瘤细胞的恶化过程可通过各种机制逃避“肿瘤免疫循环”的杀伤并获得生存，使该循环过程在各个环节被改变，从而影响T细胞杀灭靶细胞功能。其中最直接的作用就是影响并改变T 细胞。从最初的初始T 细胞分化为最终的特异性效应性T 细胞的过程中，T 细胞的状态和功能发生显著转变［14］。在这一过程中，肿瘤细胞与T 细胞间的复杂作用网络导致T 细胞效应功能减弱甚至丧失，如免疫检查点的表达、调节性T 细胞、肿瘤相关巨噬细胞、髓源抑制性细胞等负向免疫调节的细胞，抑制了T细胞效应功能的执行［15-20］。

本研究显示，半数以上HCC 患者的外周循环中可检测到TAA 特异性T 细胞免疫反应，表明特异性T 细胞的存在。这些T 细胞能够监视并作用于循环中存在的肿瘤细胞，有利于及时消灭微小的循环转移肿瘤细胞。同时，本研究结果也显示TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性患者的无复发生存期优于TAA特异性T 细胞免疫反应阴性患者，证明了TAA 特异性T 细胞能够延缓肿瘤的出现，并发挥保护作用。因此诱导产生和维持特异性T 细胞对于控制肿瘤、改善患者预后意义重大。进一步分析患者外周T细胞分化表型，结果显示，TAA特异性T细胞反应阳性患者外周循环中效应功能性CD4+/CD8+T 细胞水平显著高于阴性患者，且CD4+T 细胞可能在T 细胞清除肿瘤的过程中发挥重要作用［21］。TAA 特异性T细胞反应阳性患者CD4+T 细胞中TEM 百分比显著高于阴性患者，CD4+T 细胞对于细胞毒性T 细胞发挥杀伤功能的辅助必不可少，基于TEM 的增殖特性，有利于维持CD4+T 细胞的辅助作用。本研究还发现，虽然TAA 特异性T 细胞免疫反应阳性患者的效应性T细胞的水平相对较高，但伴随肿瘤进展，免疫检查点PD-1、CD152 的表达百分比也显著增高，表明肿瘤的进展会限制T 细胞效应功能的发挥，使更多T细胞逐渐进入功能抑制状态导致肿瘤细胞的逃逸和疾病的进展。

因此，肿瘤抗原特异性T 细胞是控制肿瘤的关键。肿瘤细胞在与免疫细胞的博弈过程中进化出各种机制诱导T 细胞向失能状态转变：识别肿瘤细胞的功能性T细胞的减少、诱导免疫检查点表达等。本研究结果提示：诱导产生效应性的特异性T细胞、阻断免疫检查点的表达是控制HCC 的重要途径。因此，肿瘤疫苗的研究和应用、嵌合抗原受体T细胞免疫疗法、免疫检查点抑制剂等方法的合理整合，在产生精准靶向肿瘤的T细胞的同时避免了免疫检查点的表达，使靶向性T 细胞维持功能，可能会为HCC的免疫治疗带来更好的疗效。