肺鳞状细胞癌预后标志物ACE2和免疫相关

郭 强 李 丹 季艳梅 郭家龙

（十堰市太和医院（湖北医药学院附属医院）胸心大血管外科，十堰 442000）

肺癌是世界上发病率和病死率最高的恶性肿瘤之一。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是肺癌的主要类型，占肺癌的85%。肺鳞状细胞癌（lung squamous cell carcinoma，LUSC）是NSCLC 的主要类型之一，占肺癌的 20%~30%［1-3］。由于癌症转移性质和缺乏诊疗生物标志物，LUSC患者的五年生存率不超过15%［4］。因此，提高LUSC患者的生存期是许多研究人员关注的焦点。目前迫切需要寻找LUSC 患者预后相关的新型标志物，以增加LUSC 患者的早期诊断和识别，进而提高LUSC患者的预后和生存期。

血管紧张素转换酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）在小肠、睾丸、肾脏、心脏、甲状腺和脂肪等中处于高表达水平，在血液、脾脏、骨髓、脑、血管和肌肉中处于低表达水平，在肺、结肠、肝、膀胱和肾上腺中的表达水平居于两者之间［5-7］。ACE2 在乳腺癌组织中的表达水平显著下调。与低表达ACE2 的乳腺癌患者相比，ACE2 高表达的患者无复发生存期（recurrence-free survival，RFS）更长。ACE2可通过VEGFa/VEGFR2/ERK 信号途径抑制乳腺癌细胞增殖、血管形成和迁移［8］。ACE2高表达与透明细胞肾细胞癌（clear cell renal cell carcinoma，ccRCC）患者的总生存期密切相关，其可抑制ccRCC患者体内外的肿瘤生长。血管内皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂（vascular endothelial growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor，VEGFR-TKI）能 降低ccRCC 细胞中ACE2 表达水平，进而影响肿瘤生长和患者生存期［9］。目前，ACE2 在 NSCLC 组织中低表达。ACE2 过表达可能通过促进VEGFa 表达而抑制体外细胞生长［10］。此外，ACE2 过表达可能通过调节MMP-2和MMP-9表达削弱A549细胞体外侵袭能力。ACE2 过表达可抑制人肺癌裸鼠成瘤生长，并降低 VEGFa、ACE 和 ACE2 受体 AT1R 的表达水平［11］。以上结果表明，ACE2 在 NSCLC 进展中具有重要作用。然而，ACE2在NSCLC 亚型LUSC 患者预后和免疫中的作用尚未见报道。本研究通过多个数据库分析ACE2 在LUSC 患者预后和免疫中的潜在价值。

1 资料与方法

1.1 UALCAN 数据库 首先，通过UALCAN（http：//ualcan. path. uab. edu）数据库分析 ACE2 mRNA 在LUSC和正常组织中的表达。其次分析ACE2 mRNA表达水平与LUSC 患者临床病理学特征（癌症分期、肿瘤分级、种族、亚型等）之间的相关性。

1.2 PrognoScan 和 Kaplan-Meier Plotter 数 据 库PrognoScan数据库（http：//www.abren.net/Progno-Scan/）数据来源于GEO 数据库中的RNA 数据。Kaplan-Meier Plotter 数据库（http：//kmplot. com/analysis/）数据来源于TCGA 和GEO 数据库的RNA 数据。本研究通过PrognoScan（筛选标准：CoxP＜0.05）和Kaplan-Meier Plotter 数据库（分组标准：最佳截断值）分析ACE2表达水平与LUSC患者预后之间的相关性。

1.3 基因富集分析 在TCGA 网站（https：//portal.gdc. cancer. gov/）下载类型为 LUSC HTSeq-FPKM 的基因表达数据。剔除49例正常肺组织基因表达数据。基因富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）是一种通过基础知识揭示基因组表达数据的方法。根据ACE2 表达中位值将TCGA 数据库中LUSC患者的基因表达数据进行高低表达分组，以探究ACE2 可能参与LUSC 进展的机制。每次分析将基因组排列1 000次，ACE2表达水平用作表型标记。

1.4 TISIDB 数据库 TISIDB（http：//cis. hku. hk/TISIDB/）数据库是肿瘤免疫相关数据库。肿瘤与免疫系统的相互作用在肿瘤的发生、发展和治疗中发挥至关重要的作用。阐明肿瘤与免疫细胞的相互作用不仅有助于预测免疫治疗反应，还有助于开发新的免疫治疗靶点。通过该数据库搜索基因名ACE2，分析ACE2 表达水平与LUSC 患者预后和免疫浸润标志物间的关系。

2 结果

2.1 ACE2 低表达与LUSC 患者临床病理学特征和预后不良相关 在UALCAN 数据库中，ACE2 在LUSC 组织中的表达水平降低（图1A）。ACE2 低表达水平与 LUSC 患者种族（CaucasianvsAsian；African-AmericanvsAsian）、癌症分期（Stage 1vsStage 4；Stage 2vsStage 4；Stage 3vsStage 4）、吸烟史［NonsmokervsReformed smoker（＞15 years）；SmokervsReformed smoker（＞15 years）；Reformed smoker（＜15 years）vsReformed smoker（＞15 years）］和组织学亚型（NOSvsPapillary）相关（图1B~E）。此外，在TISIDB 数据库中，ACE2 低表达水平与LUSC 患者组织学亚型和免疫学亚型相关（图2）。此外，在预后相关的Prog-no-Scan、Kaplan-Meier Plotter 和 TISIDB 数据库中发现ACE2高表达的LUSC患者预后较好（图3）。

图1 ACE2低表达水平与LUSC患者临床病理学特征相关Fig.1 Low expression level of ACE2 was related to clinicopathological characteristics of LUSC patients

图2 TISIDB 数据库中ACE2 低表达水平与LUSC 患者组织学亚型和免疫学亚型相关Fig.2 Low expression level of ACE2 was related to histological and immunological subtypes of LUSC patients in TISIDB database

图3 ACE2低表达的LUSC患者预后不良Fig.3 LUSC patients with low ACE2 expression have a poor prognosis

2.2 ACE2 可能参与调节LUSC 进展的信号机制GSEA 结果显示，ACE2 可能通过药物代谢细胞色素P450、磷酸戊糖途径、抗坏血酸和醛糖酸代谢、药物代谢酶、TGF-β 信号通路、ECM 受体相互作用等信号通路参与LUSC进展（表1、图4）。

图4 ACE2涉及LUSC进展的机制Fig.4 Mechanisms by which ACE2 was involved in LUSC progression

表1 GSEA显示ACE2参与调节LUSC进展的信号机制Tab.1 GSEA showed that ACE2 was involved in signaling mechanism that regulates progression of LUSC

2.3 ACE2 表达水平与LUSC 免疫浸润细胞水平相关 在TISIDB 数据库中，ACE2 低表达水平与LUSC患者免疫学亚型相关（图2）。进一步分析ACE2 表达水平与LUSC 免疫浸润细胞水平间的关系，结果表明，ACE2 表达水平与 LUSCTcm_CD8、CD56bright、iDC和TIL_Neutrophil细胞呈正相关，与Mem_B细胞呈负相关（图5）。

图5 ACE2表达水平与LUSC免疫细胞浸润水平相关Fig.5 ACE2 expression level was correlated with level of LUSC immune cell infiltration

2.4 ACE2 表达水平与LUSC 免疫调节分子水平相关 在TISIDB 数据库中，ACE2表达水平与LUSC免疫调节分子水平相关（图6~8、表2）。免疫调节分子包括免疫激活分子、免疫抑制分子、MHC 分子、趋化因子及其受体分子。ACE2 表达水平与LUSC 免疫激活分子C10orf54、HHLA2、IL6R、RAET1E、KLRC1、TNFSF18、TNFSF15、TNFRSF18和TNFSF9表达水平呈正相关，与 CD70、CXCR4、ENTPD1、TNFRSF8、TNFRSF4、TNFSF4 表达水平呈负相关（图6、表2）。ACE2 表达水平与LUSC 免疫抑制分子LGALS9、CD274、IL10RB、IDO1 和 VTCN1 表达水平呈正相关，与ADORA2A 表达水平呈负相关（表2）。ACE2表达水平与 LUSCMHC 分子 TAP2、TAP1、HLA-E 和B2M 表达水平呈正相关，与HLA-DQA2 表达水平呈负相关（表2）。ACE2 表达水平与LUSC 趋化因子CCL20、CCL26、CX3CL1、CXCL1、CXCL6、CXCL8、CXCL16 和 CXCL17 表达水平呈正相关，与 CCL2 和CCL7 表达水平呈负相关（图7）。ACE2 表达水平与LUSC 趋化因子受体分子 CCR3、CXCR1 和 CXCR2表达水平呈正相关，与CCR4、CXCR4和CCR10表达水平呈负相关（图8）。

图6 ACE2表达水平与LUSC免疫激活分子水平显著相关Fig.6 Expression level of ACE2 was significantly correlated with level of LUSC immunostimulators

图7 ACE2表达水平与LUSC趋化因子水平显著相关Fig.7 ACE2 expression level was significantly correlated with LUSC chemokine level

图8 ACE2表达水平与趋化因子受体水平显著相关Fig.8 ACE2 expression level was significantly correlated with chemokine receptor level

表2 ACE2表达水平与LUSC免疫激活分子、免疫抑制分子和MHC分子水平相关Tab.2 Expression level of ACE2 was related to levels of LUSC immunostimulators，immunoinhibitors and MHC molecules

3 讨论

研究表明，ACE2 在癌症组织中异常表达，且参与癌症进展［8-15］。例如，ACE2 在乳腺癌组织中表达下调。ACE2 高表达与乳腺癌患者长RFS 相关。ACE2 可抑制乳腺癌的生长和迁移［8，13］。血管紧张素转换酶ACE 和ACE2在滤泡性腺瘤组织中的表达水平较低，而在滤泡性甲状腺癌和乳头状甲状腺癌组织中的表达水平较高。随着甲状腺癌分化程度增加，ACE/ACE2 显著降低，而 ACE2/ACE 显著升高。在转移患者组织中，ACE 和ACE2 的表达水平均显著降低。且肿瘤肿块越大，ACE2 的表达水平越低［14］。ACE2 高表达的子宫内膜癌（uterine corpus endometrial carcinoma，UCEC）和肾乳头状细胞癌（kidney renal papillary cell carcinoma，KIRP）患者预后更好［15］。此外，ACE2 在 NSCLC 组织中表达下调，且与NSCLC 细胞生长有关［10-12］。本研究发现ACE2在LUSC 患者组织中处于低表达水平。ACE2 低表达水平与LUSC 患者种族、癌症分期、吸烟史、组织学亚型、免疫学亚型和预后不良有关。该研究结果与既往研究趋于一致［10-12］，提示ACE2 表达水平在LUSC进展中发挥极为重要的作用。

研究发现，干扰TGF-β1 表达可通过促进BRCA1 表达和Smad3 磷酸化来增加卵巢癌对药物的敏感性。体内研究表明，敲低TGF-β1 表达能通过上调BRCA1 表达和Smad3 磷酸化水平来抑制肿瘤生长［16］。Twist2 在人肾癌组织中高表达。Twist2能促进肾癌细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强肾癌衍生细胞的迁移和侵袭，并促进体内肿瘤生长。敲低Twist2 表达可降低 ITGA6 和 CD44 表达水平，抑制细胞增殖、迁移和侵袭。该结果表明Twist2 通过调节ECM 受体相互作用机制中ITGA6 和CD44 表达促进肾癌细胞进展［17］。此外，大多数肿瘤会出现多种代谢途径的致癌基因驱动，这对维持其生长和增殖至关重要［18-19］。GSEA结果显示，ACE2可能参与调节药物代谢酶、TGF-β 信号通路、ECM 受体相互作用等信号机制参与LUSC 进展。这与文献报道结果相一致，提示ACE2可能通过这些机制参与LUSC进展。

肿瘤免疫细胞浸润和免疫因子标志物与肿瘤患者预后有关［20-21］。例如，MATSUMOTO 等［22］报道CD4和CD8阳性T 细胞浸润水平与三阴性乳腺癌患者预后相关。INAGUMA 等［23］报道 CD70 阳性表达与恶性胸膜间皮瘤患者预后不良相关。ZHANG等［24］报道 CCL2 表达与 Snail 表达相关，且影响胃癌患者的预后。LI 等［25］研究表明 COVID-19 感染能使上皮细胞中细胞因子 IL-1、IL-10、IL-6 和 ACE2 表达水平增加，并激活B 细胞。在SARS-CoV 感染细胞中，ACE2 表达水平与中性粒细胞、自然杀伤细胞、Th17、Th2、Th1 和树突状细胞水平显著相关，提示T细胞被激活，进而发挥其生物学作用。SODHI等［26］报道ACE2 缺乏可导致细菌感染小鼠肺嗜中性粒细胞增多，致使过度炎症反应和肺损伤。相反，ACE2过表达会减少中性粒细胞浸润，损害宿主防御能力。ACE2 通过降低STAT3 活性来限制IL-17 信号传导，从而抑制嗜中性粒细胞浸润和肺部炎症。此外，研究报道免疫因子 HHLA2、IL6R、RAET1E2 在癌症免疫过程中具有重要作用［27-33］。例如，CHENG等［27-28］报道 HHLA2 是 B7/CD28 家族中新发现的免疫检查点成员。HHLA2 在NSCLC 组织中过表达。且在 EGFR 突变患者组织中表达更高。YIN 等［29］发现肿瘤相关巨噬细胞（tumor-associated macrophages，TAMs）与癌症患者预后不良有关。miR-204-5p 是介导TAM 诱导结直肠癌化学耐药性的功能靶标。而巨噬细胞分泌的IL-6 能激活结直肠癌细胞中IL6R/STAT3信号途径和STAT3转录，抑制肿瘤抑制因子miR-204-5p 表达，并诱导其化学抗性。CCL2/CCL12 抗体可明显减少肿瘤体积。联合治疗可增加肿瘤内CD8+T 细胞含量，以参与肿瘤的免疫应答［31］。课题组发现 ACE2 低表达与 LUSC 免疫学亚型相关。ACE2 表达水平与LUSC Tcm_CD8、CD56bright、iDC 和 TIL_Neutrophil 细胞水平呈正相关，与Mem_B 细胞水平呈负相关。ACE2 表达水平与HHLA2、IL6R、RAET1E 等表达水平呈正相关，与CD70、CCL2、CCL7 等表达水平呈负相关。本研究结果补充了LI等［25］和SODHI等［26］的研究结果，表明ACE2 表达水平与LUSC 免疫密切相关，但仍需进一步研究证实。