甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛检测方法探索及方法优化

谭桂莉

（南宁赢创美诗药业有限公司，广西 南宁 530100）

1 概述

原料药甲硫氨酸的起始物料为 DL-甲硫氨酸，生产工艺为 DL-甲硫氨酸外消旋混合物形式生产甲硫氨酸；DL-甲硫氨酸的生产物料为丙烯醛和甲硫醇，在生产过程中生成中间产物3-甲硫基丙醛［CAS号为3268-49-3，英文名称为3-（Methylthio）propanal］；中间产物进一步反应生成DL-甲硫氨酸；中间产物3-甲硫基丙醛可能未完全反应而存在于起始物料DL-甲硫氨酸中，并且随着甲硫氨酸工艺流转可能进入甲硫氨酸的产品中成为杂质，因此需在甲硫氨酸产品中对其残留含量水平进行评估。

目前，各国药典中均收载有甲硫氨酸品种，因为甲硫氨酸的工艺有来源于发酵工艺和DL-甲硫氨酸外消旋混合物化学拆分工艺，因此在各国药典收载的控制标准中均未提到对3-甲硫基丙醛的控制；3-甲硫基丙醛可作为食用香精［1］，在软饮料、冷饮、糖果、焙烤制品、调味料及肉类中使用，不属于毒性杂质；按照国际人用药品注册技术协调会（The International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）中对Q3A新原料药中杂质的要求［2］：对于每日最大剂量大于2 g的原料药，原料药中杂质的鉴定阈值为0.05%。甲硫氨酸是氨基酸类别药品，作为营养类型用药，最大日剂量可以达到10 g，3-甲硫基丙醛的限度可以设0.05%的控制限。

从3-甲硫基丙醛的结构和化学性质及从检验原理角度进行分析，气相色谱仪和高效液相色谱仪检验方法都可以满足对此物质的检验要求。

2 分析方法开发

2.1 气相色谱方法

《食品添加剂 3- 甲硫基丙醛》（GB 28341—2012）［1］中，3-甲硫基丙醛含量采用气相色谱法测定。色谱柱为毛细管柱，固定相为 5% 苯基甲基聚硅氧烷，检测器为氢火焰离子化检测器（FID）。此方法仅适用于对高浓度3-甲硫基丙醛检测，不适用于对3-甲硫基丙醛低浓度残留检测，检测方法的灵敏度达不到原料药中杂质的鉴定阈值为0.05%的要求。

借鉴GB 28341—2012中气相色谱法的色谱条件，因为3-甲硫基丙醛分子中含硫元素，所以检测器选用火焰光度检测器（FPD）代替 FID。检测中的进样口温度仍为250 ℃，采用直接进样法，此温度下的甲硫氨酸已经达到分解状态；甲硫氨酸在高温下可降解生成 3-甲硫基丙醛［3］。因此，直接进样法不适用于甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛残留检测。

为消除高温降解的影响，将直接进样法改为顶空法测试［空定量环 90 ℃ /顶空传输管 100 ℃ /GC（气相色谱仪）进样口 190 ℃］，测试结果发现，3-甲硫基丙醛对照液的水溶液为70 ℃，平衡 30 min后的气相色谱结果显示出现了远大于3-甲硫基丙醛峰的甲硫醇峰，而 3-甲硫基丙醛原样瓶上层顶空气体直接进样只检测到极少量的甲硫醇峰。产生这种现象的主要原因为3-甲硫基丙醛峰在水溶液中可分解成甲硫醇。考虑样品的溶解度，水是甲硫氨酸供试液理想的溶剂。因此，GC方法不适用于甲硫氨酸产品中对3-甲硫基丙醛的控制。

2.2 高效液相色谱方法

《美国药典》 42版（USP 42）采用高效液相色谱仪（HPLC）柱前衍生化法测定聚乙二醇3350中甲醛与乙醛的含量［4］，该方法中衍生化反应原理如图1所示；采用2-硝基苯肼衍生后液相色谱法测定3-甲硫基丙醛，理论上可以使用相似的方法测定。

图1 二硝基苯肼衍生醛类方程式

醛类衍生化后生成醛2，4-二硝基苯腙（醛-DNPH）；故可采用乙腈/水流动相+反相C18 体系，研究测试不同品牌色谱柱、流动相成分比例、流速及柱温对检测方法专属性的影响。

2.2.1 同一类型不同品牌色谱柱对检测方法专属性的影响

色谱条件如下。色谱柱：不同品牌的C18柱；流动相∶乙腈∶水 = 不同比例（v/v）；流速：不同；检测波长：350 nm；进样体积：20µL；色谱柱温度：25 ℃；分析时间：50 min；样品盘温度：10 ℃。

在流动相为乙腈∶水=50∶50（v/v）的条件下，不同品牌的C18柱（规格为4.6 mm×250 mm，5µm），相同长度粒径、碳载量及系孔径，因不同的比表面积，柱行为也有所不同。CAPCAELL PAK C18：比表面积为 260 m2/g；ODS-3V：比表面积为450 m2/g。比表面积越大，柱保留越强；结果显示这两种色谱柱中的3-甲硫基丙醛与相邻峰的分离度都达不到要求。

2.2.2 不同流动相成分比例对方法专属性的影响

色谱柱为Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7µm，在0.7 mL/min条件下，两个比例流动相条件［乙腈∶水=40∶60（v/v）和乙腈∶水=50∶50（v/v）］的结果比较：相同色谱柱在相同流速下，流动相中有机相乙腈的含量越高，目标峰的出峰越快，目标峰和相邻峰的分离度都有改善。选用乙腈∶水=50∶50（v/v）作为流动相，可缩短检测所需时间，进而提高检验效率。

2.2.3 不同流速对方法专属性的影响

色谱柱为Poroshell120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7µm，选用乙腈∶水=50∶50（v/v）作为流动相,调整色谱条件下的流速，研究不同流速（0.7 mL/min 和 0.5 mL/min）下目标峰和相邻峰的分离度改善情况，研究表明两种流速条件下的分离度没有明显改善。

2.2.4 不同柱温对方法专属性的影响

色谱柱为Poroshell120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7µm，选用乙腈∶水=50∶50(v/v) 作为流动相，调整色谱条件下的流速，研究不同柱温（40 ℃、25 ℃、20 ℃）条件下的分离效果；研究表明峰保留时间随着柱温越来越低，则保留时间越往后，目标峰和相邻峰的分离度没有明显改善，而温度高时保留时间往前移，可以缩短分析时间。

以上测试结果显示，乙腈/水流动相体系检测灵敏度明显好于气相色谱法。1 mg/L的3-甲硫基丙醛对照液表现出良好的信噪比。通过局部调整参数，虽然可以使目标峰与相邻峰的分离度改善，但是并未能达到理想的分离程度，需要进一步调整分析方法和条件。

2.3 高效液相色谱分析方法和条件优化

乙腈（ACN）和甲醇（MeOH）都是反向色谱柱方法开发中广泛使用的两种常见溶剂，而乙腈比甲醇有更高的洗脱能力，为了减小流动相的洗脱能力，将流动相体系从乙腈/水改为甲醇/水流动相进行测试。其他色谱条件不变，仅改变流动相的比例，研究3-甲硫基丙醛和相邻峰的分离度改善情况。

色谱条件如下。色谱柱：Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7µm；流动相∶甲醇∶ 水 = 不同比例（v/v）；流速：0.7 mL/min；检测波长：350 nm；进样体积：20µL；色谱柱温度：25 ℃；样品盘温度：10 ℃。

基于不同流动相成分比例的甲醇和水，使用反向高效液相色谱方法分离1 mg/L 3-甲硫基丙醛，结果如图2所示。

图2 反向高效液相色谱方法分离3-甲硫基丙醛的图谱

由图2可知：①甲醇∶水=60∶40（v/v），3-甲硫基丙醛的保留时间为 16.2 min，分离度符合要求；甲醇∶水=50 ∶ 50（v/v），3- 甲硫基丙醛的保留时间为 45.1 min，分离度符合要求。②流动相中甲醇∶水为50∶50或60∶40都有很好的分离度，皆可满足检验的方法学要求。

考虑合理的分析时间，选择以下色谱条件对检验方法进行确认。

甲硫加标供试液（L-Met1601180708+0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛）目标峰峰纯度测试，结果如图3所示。

图3 甲硫加标供试液目标峰峰纯度测试图谱

结果显示：对照液目标峰与相邻峰可以实现基线分离，二极管阵列（DVD）检测器峰纯度测试分值为999.99。表明该方法具备良好的专属性。

3 分析方法初步确认

以上结果显示： 2-硝基苯肼衍生后使用高效液相色谱仪（HPLC）方法检测 3-甲硫基丙醛是可行的。为了进一步考察该方法对使用目的的适用性，对实施方法进行方法确认。

3.1 色谱条件

色谱柱： Agilent Infinity Lab Poroshell 120 EC-C18 4.6 mm×100 mm，2.7µm（货 号：695975-902T； 批 号：USCFS13303）；流动相：甲醇∶水=60∶40（v/v）；流速：0.746 mL/min；检测波长：350 nm；进样体积：20 µL；色谱柱温度：25 ℃；分析时间：30 min；样品盘温度：10 ℃。

3.2 溶液配制

流动相：取色谱纯甲醇与超纯水按60∶40（v/v）混匀，以0.45µm有机系滤膜过滤后使用。反应液：称取100 mg±5% 2，4-二硝基苯肼（生产厂家：国药集团化学试剂有限公司，批号：20170817）于容瓶中，加入300 mL 乙腈溶解后，加入 700 mL 超纯水，再加入 60 µL浓硫酸混合均匀密封备用。空白：取反应液在 60 ℃水浴中反应 30 min，冷却后进样。供试液配制：称取甲硫氨酸供试品（L-Met1601180708） 0.2 g 到 10 mL 容量瓶中，加反应液约 9.5 mL 溶解样品后于 60 ℃水浴中反应 30 min，冷却后用反应液定容至刻度。

（1）3-甲硫基丙醛对照液配制。称取 3-甲硫基丙醛C（生产厂家：麦克林，批号：10219821）20 mg 于 100 mL容量瓶中，以甲醇溶解并定容到刻度，得对照液A，浓度为 200 mg/L。移取对照液 A 2.50 mL 到 50 mL 容量瓶中，以甲醇定容到刻度，得浓度为 10 mg/L，此溶液定为对照液 B。取对照液 A 0.5 mL 于 10 mL 容量瓶中，加反应液约 9.5 mL 在 60 ℃水浴中反应 30 min，冷却后用反应液定容，浓度为 10 mg/L，相当于成品控制限度 0.05%。取对照液 B 0.5 mL 于 10 mL 容量瓶中加入反应液约 9.5 mL 并在 60 ℃水浴中反应 30 min，冷却后用反应液定容，浓度为 0.5 mg/L。

（2）加标供试液配制。称取 L-甲硫氨酸供试品（L-Met1601180708）0.2 g 到 10 mL 容量瓶中，加入 0.5 mL对照液B，用约 9 mL反应液使样品完全溶解后在 60 ℃水浴中反应 30 min，冷却，用反应液定容。

3.3 确认程序

按照《中华人民共和国药典2020年版·四部》［5］中分析方法验证指导原则要求：专属性测试中目标物应不受其他峰干扰；线性回归相关系数不小于0.99；进样重复性相对标准偏差（RSD）不大于1%；准确性范围：80%～120%；检出限度（LOD）：信噪比大于3∶1；定量限度（LO）：信噪比大于10∶1。

3.3.1 专属性

分别取空白、反应后 0.5 mg/L 3-甲硫基丙醛对照液、供试液和加标供试液进样检测。结果显示：3-甲硫基丙醛保留时间约 17 min，空白、供试液和加标供试液均显示目标峰检测无干扰，符合方法学要求。

3.3.2 线性

分别从对照液A 或对照液B 吸取一定量溶液于 10 mL容量瓶中加入反应液 10 mL 使成 0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L 和 5.0 mg/L 3- 甲硫基丙醛对照液于60 ℃水浴中反应 30 min，冷却进样，以峰面积对浓度做线性回归。结果显示：在0.1～5 mg/L 范围内，浓度依次为0.1 mg/L、0.5 mg/L、1.0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L 的峰面积依次为 8.58、47.87、101.88、191.68、537.30，其线性相关系数R=0.999，满足方法学不小于0.99的要求。

3.3.3 进样重复性

取 0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛对照液连续进样 6 次，结果 显 示： 峰 面 积 依 次 为 47.87、47.70、47.06、47.36、47.19、47.59；3-甲硫基丙醛峰面积的相对标准偏差为0.66%，满足方法学不大于1%的要求。

3.3.4 准确性

分别取 3 份 0.5 mg/L 3- 甲硫基丙醛对照液、3 份供试液及 3 份加标供试液 C 3- 甲硫基丙醛加标浓度 0.5 mg/L，进样，计算加标回收率。结果显示：3份加标供试液的加标回收率依次为92.37%、91.58%、92.70%，满足方法学加标回收率在80%～120%的要求。

3.3.5 定量限和检测限

分别配制 3 份 0.05 mg/L 3- 甲硫基丙醛对照液和 3份 0.02 mg/L 3- 甲硫基丙醛对照液进样，计算目标峰的信噪比。0.05 mg/mL 的信噪比分别为 11.5、9.3 和 8.6 ；0.02 mg/mL 的信噪比分别为 5.1、6.0 和 5.6；以信噪比约10 推算的方法的定量限约0.05 mg/L。结果显示：所配制的检测限测定用对照液信噪比均大于5。因此推断，以信噪比约 3 推算的检测限可能会达到 0.01 mg/L。

3.3.6 溶液稳定性

取1份0.5 mg/L 3-甲硫基丙醛对照液多次进样，时间间隔为 0、4.2 h、24.1 h 的峰面积依次为 47.87、47.59和48.16；峰面积的相对标准偏差（RSD%）为0.59%；取1 份供试液多次进样时间间隔为 0、13.0 h、23.0 h、30.3 h的3-甲硫基丙醛峰面积皆为0，显示供试液在长达30 h的储存期，供试液未降解出3-甲硫基丙醛。取1份加标供试液多次进样时间间隔为 0、13.0 h、23.0 h、30.3 h 的 3-甲硫基丙醛峰面积依次为 44.78、44.03、44.23、43.88，3-甲硫基丙醛峰面积的RSD% 为0.89%。结果显示：加标供试液可稳定存放30 h。

4 结束语

本研究主要比较气相色谱检测方法和液相色谱检测方法测定甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛残留的可行性,研究结果证实气相色谱法中氢火焰离子化检测器（FID）和火焰光度检测器（FPD）皆不适合甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛残留的测定。

采用液相色谱检验方法，利用2，4-二硝基苯肼可衍生化醛类的方式，通过比较不同碳载量的C18色谱柱、不同填料孔径和填料比表面积的柱子对方法分离效果的影响，筛出适合的色谱柱；再经过优化方法中的条件如柱温、流动相配比及流速，得到适合甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛的检测方法条件，依据《中华人民共和国药典2020年版·四部》中分析方法验证指导原则［5］对方法进行确认，方法确认结果符合规定，表明该方法可用于甲硫氨酸中3-甲硫基丙醛的测定。