基于OPG/RANKL信号通路探讨补肾活血方改善骨质疏松大鼠动脉钙化的作用机制

林晓容，杨 娜，郑 琲，赵 虎，徐军霞，4*

1 福建中医药大学康复医学院，福建福州 350122；2 福建省军区福州第六干休所，福建福州 350013；3 中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院，福建福州 350025；4 福建中医药大学福总教学医院，福建福州 350025

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨量减少和骨组织微结构退化为特征的进行性、系统性疾病，其引发的骨质脆弱和骨折易感性增加会使患者出现病理性疼痛、骨折甚至死亡［1］。血管钙化（vascular calcification，VC）是血管系统发生病理性矿物质沉积的过程。研究显示，OP和VC密切相关，两者均是伴随衰老而发生的退行性病变，大大增加了病理性骨折和心脑血管事件发生的风险［2-4］，是老年人主要的死亡和致残原因之一［5］，给患者、家庭和社会带来巨大的经济和健康负担。中国中医科学院望京医院张宁团队研究发现，补肾活血方不仅能减轻骨丢失，还可影响血管钙化的发展［6］。但其具体作用机制尚不明确。研究显示，骨保护素（osteoprotegerin，OPG）/核因子κB 活化因子受体配体（receptoractivator of NF-κB ligand，RANKL）信号通路参与包括OP 在内的多种骨骼疾病的发生、发展［7］，且在抑制VC 中起重要作用［8］。OPG/RANKL 信号通路可能是OP 和VC 共同发病机制之一［9-10］。因此本研究通过行双侧睾丸切除术制备雄性大鼠骨质疏松模型［11］，给予补肾活血方进行干预，观察大鼠骨密度（bone mass density，BMD）水平、胸主动脉钙化情况、血清骨代谢标志物和胸主动脉OPG/RANKL 信号表达情况；基于OPG/RANKL 信号通路探讨补肾活血方改善骨质疏松大鼠动脉钙化的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物

选择健康SPF 级雄性SD 大鼠32 只，7 月龄，体质量（575±75）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号：SCXK（京）2016-0011。所有大鼠在SPF 级标准动物实验室中喂养，自由饮水与摄食，光照12 h，室温20～25 ℃，相对湿度45%。本实验方案经中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院实验动物伦理委员会审批通过。

1.2 实验药物

补肾活血方主要由当归15 g、熟地黄10 g、淫羊藿10 g、丹参10 g、补骨脂10 g、生黄芪15 g和酒制大黄5 g 组成。将生药浸于750 mL 蒸馏水30 min，武火煮沸后文火煎煮30 min，反复煎煮2 次，合并2次药液，浓缩至3 g/mL，冷藏备用。以上药物购自福建海药股份有限公司，由中国人民解放军联勤保障部队第九〇〇医院中药房煎制。

1.3 主要试剂与仪器

茜素红S 液（美国Sigma 公司）；大鼠Ⅰ型前胶原氨基端原肽（procollagen typeⅠN-terminal propeptide，PⅠNP）、骨钙素（bone Gla-protein，BGP）、Ⅰ型胶原C-末端肽交联（CTX-Ⅰ）ELISA 检测试剂盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）；OPG、RANKL 抗体（英国Abcam 公司）；羊抗兔二抗（美国Millipore 公司）；DAB显色液（加拿大Fermentas公司）；戊巴比妥钠（美国Sigma 公司）；双能X 线吸收仪（美国Hologic公司）；4、-20、-70 ℃冰箱（青岛海尔股份有限公司）；掌式离心机（江苏林贝尔仪器制造有限公司）；蒸汽压力灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）；恒温箱（常州国华电器有限公司）；光学显微镜（日本Olympus 公司）；切片机（德国徕卡公司）；包埋机（英国Shandon公司）。

1.4 实验方法

1.4.1 动物分组与模型制备 32 只SPF 级雄性SD大鼠按随机数字表法分为对照组、假手术组、骨质疏松组、补肾活血组，每组8 只。对照组无任何处理，假手术组仅暴露睾丸但不切除；骨质疏松组和补肾活血组切除双侧睾丸。

1.4.2 干预方法 于睾丸切除术后第16 周开始干预，补肾活血组予补肾活血方灌胃，给药剂量按体表面积比换算，按照临床等效4倍剂量计算［12］，剂量55 g/（kg·d）。对照组、假手术组和骨质疏松组均予等量生理盐水灌胃，1次/d，连续给药8周。

1.5 观察指标

1.5.1 骨密度检测 干预结束后处死大鼠，取大鼠右后侧股骨，剔除附着于骨表面的软组织，保持股骨完整，0.9% NaCl 溶液冲洗并用纱布包好置于-70 ℃冰箱待检；采用双能X 线吸收仪对大鼠股骨进行扫描，用小动物测量软件对股骨干骺端进行BMD分析。

1.5.2 胸主动脉钙化情况观察 4 组大鼠胸主动脉段各剪取约0.5 cm，置于10%福尔马林溶液中固定，乙醇梯度逐级脱水后二甲苯透明，进行石蜡包埋，切片（厚度4 μm）后恒温箱60 ℃烤片30 min，二甲苯脱蜡，乙醇梯度复水，2%茜素红S 液染色1～5 min，1%盐酸酒精分化，乙醇梯度脱水，二甲苯透明，最后用中性树脂进行封片，置于显微镜下观察拍照，并进行大鼠胸主动脉血管壁钙沉积积分光密度（integrated optical density，IOD）值分析。

1.5.3 大鼠血清PⅠNP、BGP、CTX-Ⅰ浓度检测 以2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）深度麻醉大鼠，腹主动脉取血10 mL，静置于肝素钠抗凝管中，4 ℃3 500 r/min离心5 min，取上清液。采用ELISA法检测血清PⅠNP、BGP 和CTX-Ⅰ的浓度，具体操作参照试剂盒说明书进行。

1.5.4 大鼠胸主动脉OPG、RANKL蛋白表达水平检测 取胸主动脉石蜡组织切片，进行脱蜡和水洗后使用磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）冲洗，高压修复抗原，再用3%过氧化氢室温下封闭10 min，然后用PBS 冲洗，加非特异性血清30 min 后弃去，分别滴加一抗OPG（1∶100）、RANKL（1∶200），另外设置以PBS 代替一抗的切片为阴性对照，于4 ℃冰箱内过夜，PBS漂洗3次，5 min/次，滴加二抗，37 ℃静置30 min，DAB 显色1～3 min，自来水冲洗5 min，苏木素复染、脱水、透明、封片、镜下观察拍照。采用Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统进行免疫组化染色半定量分析，每只大鼠胸主动脉组织取3张切片，每张切片随机取10个高倍视野，计算每个视野阳性表达IOD 值，用阳性表达IOD 值表示胸主动脉组织OPG、RANKL蛋白的表达水平。

1.6 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计软件进行数据分析。数据符合正态分布以（±s）表示，多组比较采用单因素方差分析，两两比较方差齐时采用LSD-t法，方差不齐时采用Tamhane法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结 果

2.1 4 组BMD、胸主动脉血管壁钙沉积IOD 值比较

与对照组比较，骨质疏松组BMD 水平明显降低，胸主动脉血管壁钙沉积IOD 值明显升高（P＜0.05）。与骨质疏松组比较，补肾活血组BMD 水平明显升高，胸主动脉血管壁钙沉积IOD值明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1 4组BMD、钙沉积IOD比较（±s）Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups（±s）

表1 4组BMD、钙沉积IOD比较（±s）Table 1 Comparison of BMD and IOD of calcium deposition in four groups（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与骨质疏松组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group, 1) P＜0.05; compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

组别对照组假手术组骨质疏松组补肾活血组n8888 BMD/（g/cm2）0.312 3±0.011 5 0.310 4±0.015 7 0.263 6±0.009 61）0.280 2±0.005 02）钙沉积IOD值0.00±0.00 0.00±0.00 1 328.55±125.081）507.16±61.752）

胸主动脉茜素红染色结果显示，对照组和假手术组胸主动脉血管壁未见橘红色颗粒沉着，骨质疏松组胸主动脉血管壁可见大量散在小片状深橘红色颗粒样沉积，补肾活血组胸主动脉血管壁只见少量散在浅橘红色颗粒样沉积。见图1。

图1 4组胸主动脉钙化比较（×40）Figure 1 Comparison of calcification of thoracic aorta in four groups(×40)

2.2 4组大鼠血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ水平比较

与对照组比较，骨质疏松组血清PⅠNP、BGP 水平明显降低，骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）。与骨质疏松组比较，补肾活血组PⅠNP、BGP 水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05），而CTX-Ⅰ水平无明显区别，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2、图2。

图2 4组血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ浓度比较Figure 2 Comparison of PⅠNP,BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups

表2 4组血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ浓度比较（±s） ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP，BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups（±s） ng/mL

表2 4组血清PⅠNP、BGP和CTX-Ⅰ浓度比较（±s） ng/mLTable 2 Comparison of PⅠNP，BGP and CTX-Ⅰof serum in four groups（±s） ng/mL

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与骨质疏松组比较，2）P＜0.05。Note:Compared with the control group,1)P＜0.05;compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

组别对照组假手术组骨质疏松组补肾活血组n8888 PⅠNP 59.48±13.70 58.50±14.88 42.37±7.631）56.72±11.502）BGP 10.75±1.39 10.48±1.72 8.39±1.451）10.33±1.762）CTX-Ⅰ5.08±1.23 5.60±1.09 8.39±1.451）5.87±1.61

2.3 4 组胸主动脉OPG、RANKL 蛋白表达水平比较

OPG 免疫组化染色结果显示，对照组、假手术组大鼠血管壁平滑肌层细胞质可见大量深染棕黄色颗粒沉着；骨质疏松组大鼠血管壁平滑肌层细胞质只见少量浅染棕黄色颗粒；补肾活血组大鼠血管壁平滑肌层细胞质可见中等量棕黄色颗粒沉着。RANKL 免疫组化染色结果显示，对照组、假手术组大鼠血管壁平滑肌层细胞质只见少量浅染棕黄色颗粒沉着；骨质疏松组大鼠血管壁平滑肌层细胞质可见大量深染棕黄色颗粒；补肾活血组大鼠血管壁平滑肌层细胞质可见中等量棕黄色颗粒沉着。见图3。

图3 4组胸主动脉OPG/RANKL蛋白表达情况（×20）Figure 3 Expression of OPG/RANKL protein of thoracic aorta in four groups(×20)

与对照组比较，骨质疏松组大鼠胸主动脉OPG表达水平明显降低，RANKL 表达水平明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）；与骨质疏松组比较，补肾活血组大鼠胸主动脉OPG 表达水平明显增加，RANKL 表达水平明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 4组胸主动脉OPG、RANKL IOD值比较（±s）Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups（±s）

表3 4组胸主动脉OPG、RANKL IOD值比较（±s）Table 3 Comparison of IOD of OPG and RANKL of thoracic aorta in four groups（±s）

注：与对照组比较，1）P＜0.05；与骨质疏松组比较，2）P＜0.05。Notes:Compared with the control group, 1) P＜0.01; compared with the osteoporosis group,2)P＜0.05.

组别对照组假手术组骨质疏松组补肾活血组n8888 OPG IOD值10 531.63±1 308.15 11 086.47±1 259.55 3 508.52±425.691）7 635.48±1 168.552）RANKL IOD值2 518.87±310.06 2 704.37±325.91 4 532.85±526.751）3 526.11±467.852）

3 讨 论

中医学将OP 归于“骨痹”“骨痿”等范畴，其病因病机与肾息息相关。肾藏精，主骨生髓，骨骼的生长发育需要肾精气的濡养，肾精不足，髓失所养，易发骨痿。而VC 与“瘀血”“痰浊”等病症相似，血管属中医学“脉”的范畴。心主血脉，心失所养，血行不畅，日久因虚而生瘀血痰浊。《景岳全书》曰：“心本乎肾，所以上不宁者，未有不由乎下，心气虚者，未有不因乎精。”OP、VC 与“心肾”功能密切相关。二者共同发病的中医病机为肾虚血瘀，以补肾活血法治疗符合OP和VC肾虚血瘀的发病病机。

3.1 补肾活血方可以有效改善去势大鼠骨质疏松并抑制动脉钙化

BMD 是国际公认的诊断骨质疏松的金标准。本研究结果显示，与对照组比较，骨质疏松组BMD水平明显降低，胸主动脉可见大量散在的钙化沉积。这提示，切除大鼠睾丸可导致BMD 下降，引发骨质疏松和胸主动脉钙化的发生。这可能与去睾丸大鼠骨代谢失衡引起异常的钙磷矿物质在血管系统中沉积，促进血管钙化形成有关［13-14］。骨形成标志物PⅠNP、BGP 和骨吸收标志物CTX-Ⅰ水平是临床上常用于评估老年性骨质疏松治疗效果的重要指标，具有较高敏感性和特异性［15］。本研究结果显示，与骨质疏松组比较，补肾活血组大鼠BMD 水平、血清PⅠNP 和BGP 水平明显升高，这提示补肾活血方可通过提高骨质疏松大鼠的骨形成水平，调节骨代谢失衡，从而有效改善大鼠骨质疏松。此外，补肾活血组大鼠胸主动脉钙化沉积较骨质疏松组明显减少，这提示补肾活血方可在一定程度上抑制骨质疏松大鼠胸主动脉血管壁钙化。这初步证实了补肾活血方用于治疗OP 和VC 具有良好的效果。这可能与以下原因有关：补肾活血方中淫羊藿和熟地黄合用，阴阳双补；补骨脂温肾壮阳；丹参活血化瘀；黄芪益气活血；当归活血通经；大黄祛瘀泄浊。全方壮筋骨通血脉，补肾活血以去除肾虚血瘀之证，从而抑制OP 和VC 的发生、发展。这与肖亚平等［16-17］研究发现补肾中药可生精壮骨、活血通脉的结果一致。

3.2 补肾活血方改善OP 大鼠骨质疏松、动脉钙化可能与OPG/RANKL信号通路有关

RANKL 与破骨细胞前体细胞表面的核因子кB活化因子受体（receptor activator of nuclear factorkappa B，RANK）结合，可诱导破骨细胞分化成熟，促进骨吸收，而通过刺激OPG 竞争性与RANKL 结合，抑制破骨细胞生长活性和骨吸收，平衡骨代谢水平，改善骨微结构［18］。本研究结果显示，与骨质疏松组比较，补肾活血方组BMD 水平、OPG 表达水平明显上升，RANKL 表达水平明显下降。这提示，补肾活血方可提高OPG 表达，降低RANKL 表达，改善去势大鼠骨质疏松和动脉钙化情况。其具体机制可能与以下因素有关：①补肾活血方中淫羊藿苷能够上调OPG 表达，补骨脂素提高OPG 表达和降低RANKL 表达，从而抑制破骨细胞的分化成熟，促进骨形成［19］。②血管钙化的发生与OPG 低表达、RANKL 高表达密切相关［20］，RANKL 与RANK 结合可上调骨碱性磷酸酶活性，促进血管平滑肌细胞成骨样变，形成血管钙化。补肾活血方可使OPG 表达上升，RANKL 表达下降，而OPG 与RANKL 结合可抑制骨质疏松大鼠胸主动脉钙化的发生与进展［8］。这提示，补肾活血方改善OP 大鼠动脉钙化可能与OPG/RANKL信号通路调控有关。

4 小 结

综上所述，补肾活血方能提高骨质疏松大鼠BMD 水平，促进骨形成，改善其诱导的动脉钙化情况。作用机制可能与其能上调OPG 表达，抑制RANKL 表达，调控胸主动脉中OPG/RANKL 信号通路的表达有关。本研究为补肾活血方的临床应用提供了一定理论依据，但补肾活血方具有多靶点、整体调节效应，其具体作用机制还需进一步深入研究。