药用胶塞中抗氧化剂的测定及其向药品中的迁移研究

张锡云，王爱秀，许 艳，路青云，崔毓城，陈苏玲，张慧云，杨 宁，田 园，李小娟，朱衍志△

(1.兰州生物技术开发有限公司，甘肃 兰州 730046；2.甘肃省食品药品检定研究院，甘肃 兰州 730070)

高效液相色谱法(HPLC)是采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法。注入的供试品由流动相带入色谱柱内，各组分在柱内被分离，并进入检测器检测，由积分仪或数据处理系统记录和处理色谱信号。HPLC仪器由高压输液泵、进样器、色谱柱、检测器、积分仪或数据处理系统组成[1]。目前，HPLC广泛应用于生命科学、食品科学、药物研究及环境研究中。

药用丁基橡胶塞作为常见的内包材之一，广泛应用于各类注射剂产品中[2-3]。橡胶中含有不饱和的双键,在使用过程中易被氧化，所以在生产过程中通常加入抗氧剂，常见的抗氧剂有抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168和抗氧剂BHT等。根据《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则(试行)》[4]中塑料包装材料添加剂及限度要求，其中抗氧剂BHT添加量应不超过0.125%，其他抗氧剂添加量均应不得超过0.3%；每种包装材料中添加抗氧剂的种类不能超过3种，且总量不得超过0.3%。因此，本研究尝试建立了可同时测定这5种抗氧化剂的HPLC法，并采用该方法测定了胶塞中抗氧化剂向注射用A型肉毒毒素(BTXA)中的迁移情况。

1 材料与方法

1.1材料 抗氧剂1010(批号:5692-01)、抗氧剂330(批号：5691-01)、抗氧剂1076(批号：5691-01)、抗氧剂168(批号：5690-01)均购自美国AccuStandard公司；抗氧剂BHT(2,6-Di-ter-butyl-4-methylpheno)购自德国Dr.Ehrenstorfer GmbH公司，含量99.5%。BTXA(批号：试20191206-1、试20191206-2、试20191206-3)由兰州生物技术开发有限公司提供。

1.2仪器与试剂 Thermo高效液相色谱仪(型号：UItiMate 3000)、DAD检测器、电子天平(型号：MS 205DU)。甲醇、无水乙醇、乙腈、四氢呋喃和二氯甲烷为色谱纯，试验用水为纯化水。

1.3方法

1.3.1色谱条件 色谱柱为岛津Inertsil ODS-3 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为乙腈-四氢呋喃-水(62∶30∶8)[5]，流速1.5 mL/min，柱温35 ℃，检测波长278 nm，进样体积20.0 μL。

1.3.2系统适用性 分别精密称取抗氧剂1010、抗氧剂1076、抗氧剂168、抗氧剂330和抗氧剂BHT 10.0 mg，置于同一100 mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液(5∶2)[6]溶解并稀释至刻度并摇匀，作为系统适用性溶液。将系统适用性溶液连续进样6次，记录色谱峰的响应值、理论塔板数和分离度。

1.3.3线性范围

1.3.3.1对照品储备液配制 分别精密称取抗氧剂1010、抗氧剂1076、抗氧剂168、抗氧剂330 20.0 mg和抗氧剂BHT 15.0 mg，置于同一50.0 mL容量瓶中，加入甲醇-二氯甲烷溶液溶解并稀释至刻度并摇匀，作为对照品储备液。

1.3.3.2线性范围测试 分别精密量取对照品储备液1.0、1.0、5.0、1.0、1.0 mL，分别置5.0、10.0、100.0、25.0、50.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度并摇匀，作为建立标准曲线的对照品溶液(分别记为A～E组)，具体相关浓度见表1。将上述对照品溶液按1.3.1的色谱条件分别进样分析，每个质量浓度重复测定3次，以待测物质浓度为横坐标，峰面积平均值为纵坐标，绘制标准曲线。

表1 抗氧剂线性浓度(μg/mL)

1.3.4准确度

1.3.4.1BTXA回收率实验 加标供试品溶液制备：取2支BTXA，精密称取内容物约20.0 mg，置于5.0 mL容量瓶中，加适量甲醇-二氯甲烷溶液，再分别加入对照品储备液100.0、150.0、200.0 μL(分别标记为F～H组)超声10 min，冷却后用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度，摇匀，过滤，取滤液。同法制备空白溶液。每种加标样品溶液平行制备3份，分别进行测定。

1.3.4.2胶塞回收率实验 加标供试品溶液制备：精密称取胶塞(剪碎)5.0 g，置烧瓶中，精密加入无水乙醇25.0 mL，再精密加入对照品储备液200.0、300.0、400.0 μL(分别标记为I～K组)，小于《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则》[7]中抗氧剂最大添加量。称定重量，置电热炉上加热回流4 h，放冷，用无水乙醇补足重量并摇匀，过滤，取滤液。同法制备空白溶液。每种加标样品溶液平行制备3份，分别进行测定。

1.3.5重复性

1.3.5.1BTXA重复性实验 精密量取对照品储备液1.0 mL，置于50.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度并摇匀，作为对照品溶液。精密称取BTXA内容物20.0 mg(2支)，置于5.0 mL容量瓶中，加适量甲醇-二氯甲烷溶液，再加入对照品储备液0.1 mL，超声10 min，冷却后用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度并摇匀，过滤，取续滤液，作为供试品溶液。每种供试品溶液平行制备6份，采用外标法分别进行测定。

1.3.5.2胶塞重复性实验 精密量取系统适用性溶液3.0 mL，置于10.0 mL容量瓶中用无水乙醇稀释至刻度并摇匀，即得对照品溶液。精密称取胶塞(剪碎)5.0 g置于烧瓶中，加入25.0 mL精密量取的无水乙醇，称定重量，置电热炉上加热回流4 h，冷却后用无水乙醇补足重量并摇匀，过滤，取滤液。同法制备空白溶液。平行制备6份胶塞浸提液，采用外标法分别进行测定。

1.3.6检出限和定量限 精密量取对照品储备液1.0 mL，置于100.0 mL容量瓶中，用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度并摇匀，作为定量限和检出限溶液。精密量取不同体积(分别为1.0、1.5、4.0、11.0 μL)溶液注入液相色谱，记录色谱峰的响应值，计算信噪比，考察其检出限及定量限的范围。

1.3.7稳定性 取系统适用性溶液20.0 μL进样，每2小时进样1次，连续进样24 h，记录色谱峰的响应值。

1.3.8抗氧剂在药液中的迁移 取加速条件下的BTXA 3批，分别于1、2、3、6个月测定BTXA中的抗氧剂，具体操作方法如下：取BTXA 2支，精密称取内容物20.0 mg，置5.0 mL量瓶中，加适量甲醇-二氯甲烷溶液，超声10 min，放至室温，用甲醇-二氯甲烷溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。同法制备空白溶液，按外标法计算含量。

2 结 果

2.1系统适用性 各抗氧剂重复性相对标准偏差(RSD)均小于0.7%，分离度均大于1.5。典型色谱图见图1，色谱峰的理论塔板数和分离度见表2。

表2 抗氧剂系统适用性

1.抗氧剂BHT；2.抗氧剂1010；3.抗氧剂330；4.抗氧剂1076；5.抗氧剂168。

2.2线性范围及相关系数 抗氧剂含量与峰面积平均值呈线性相关(P<0.000 1)。见表3。

表3 抗氧剂线性范围及相关系数

2.3准确度

2.3.1BTXA回收率实验 BTXA中抗氧剂回收率为95%～105%，见表4。

表4 抗氧剂在BTXA中的回收率(%)

2.3.2胶塞回收率试验 胶塞中抗氧剂回收率为87%～109%，见表5。

表5 抗氧剂在胶塞中的回收率(%)

2.4重复性

2.4.1BTXA重复性实验 由于BTXA中未检测到抗氧剂，因此采用加标方法，作为重复性实验。抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的重复性RSD值分别为3.6%、3.4%、3.7%、4.3%、4.7%，见表6。

表6 BTXA中抗氧剂重复性实验结果(μg/mL)

2.4.2胶塞重复性试验 胶塞中仅检出抗氧剂BHT，平均为0.014 2%，抗氧剂BHT的重复性RSD为1.9%，见表7。胶塞色谱图见图2。

表7 胶塞中抗氧剂重复性实验结果

图2 胶塞色谱图

2.5定量限和检出限 不同抗氧剂检出限范围为3.1～16.5 ng，定量限范围为4.6～45.5 ng。见表8。

表8 抗氧剂定量限和检出限范围(ng)

2.6稳定性 抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168的峰面积RSD值分别为0.3%、0.5%、0.4%、0.6%、0.4%。

2.7抗氧剂在BTXA中的迁移情况 BTXA中均未检出抗氧化剂。见表9。

表9 抗氧剂在BTXA中的迁移情况

3 讨 论

直接接触药品的胶塞，在药品销售储运过程中氧化剂可能会渗透或迁移到药品中，并随着药品进入人体，可能导致严重的不良反应[8-12]。因此,有必要对胶塞中抗氧化剂的含量进行检测和控制。目前，用于药用胶塞抗氧化剂检测的方法主要有3种。(1)气相色谱法：利用气体作流动相的色谱分离分析方法。汽化的试样被载气(流动相)带入色谱柱中，柱中的固定相与试样中各组分分子作用力不同，各组分从色谱柱中流出时间不同[1]。该方法主要用来检测分子量低及对热不敏感的抗氧化剂，如抗氧化剂BHT等。(2)液相色谱法：采用高压输液泵将规定的流动相泵入装有填充剂的色谱柱，对供试品进行分离测定的色谱方法[13]。(3)在线检测技术：该技术是近年来的一种创新型检测方法，主要利用先进的接口实现设备智能的串联，逐步实现智能化检测，从而实现样品在线检测。如固相微萃取-气相色谱-串联质谱在线检测技术及凝胶渗透色谱-高效液相色谱-串联质谱在线检测技术，都有极好的应用前景[14-15]。目前，在线检测技术的检测成本较高。

本研究建立了可用于检测胶塞及BTXA中抗氧剂BHT、抗氧剂1010、抗氧剂330、抗氧剂1076、抗氧剂168含量的HPLC法。根据目前欧洲药品局推荐的遗传毒性致癌物的安全性阈值为每天1.5 μg国际药用气雾剂联盟推荐的吸入制剂的安全性阈值为每天0.15 μg[16]。本研究建立的HPLC法的检出限为3.1～16.5 ng,定量限为4.6～45.5 ng，远小于上述推荐值，提示该方法灵敏度符合要求。本研究结果显示，各抗氧剂线性相关系数均大于0.999，重复性RSD均小于0.7%，具有较好稳定性。本研究选择甲醇-二氯甲烷溶液作为溶解液，其既可以溶解样品，又可以溶解待测5种氧化剂。本研究结果显示，BTXA中抗氧剂重复性RSD均小于4.7%，胶塞中抗氧剂BHT的重复性RSD为1.9%，BTXA中抗氧剂回收率为95%～105%，胶塞中抗氧剂回收率为87%～109%，均符合《分析方法验证指导原则》的相关要求[17]。本研究中在胶塞中仅检出抗氧剂BHT，平均为0.014 2%。胶塞中抗氧剂符合《化学药品注射剂与塑料包装材料相容性研究技术指导原则(试行)》中塑料包装材料添加剂及限度要求。同时，取加速条件下的BTXA 3批，分别于1、2、3、6个月测定BTXA中的抗氧剂，结果均未检出，提示胶塞中抗氧剂BHT未向BTXA中发生迁移。

综上所述，本研究建立的HPLC法具有操作简单、方法准确可靠且分析成本较低的优点，可用于BTXA与药用卤化丁基胶塞相容性研究的常规分析与质量评价。