复方黄连汤治疗食管癌的作用机制分析*

周美玉，王 伟，刘 立，杨在亮，谭永红

(重庆市涪陵中心医院肿瘤血液科，重庆 408000)

食管癌是消化道的常见肿瘤之一，其不但发病率高，且死亡率更高，居全球癌症死亡数的第6位[1-2]。食管癌多见于中老年男性，其中90%以上为鳞状细胞癌，其次为腺癌。食管癌具有高度侵袭性、浸润性、转移性等特征，可导致患者预后较差，5年生存率不超过20%[3-4]。食管癌患者出现进行性吞咽梗阻、声音嘶哑、饮水呛咳等典型临床表现时，多数已进展至中晚期，即使给予手术、化疗、放疗及免疫治疗等多种治疗方式，该类患者仍不能很好地达到根治目的且容易复发[5]。随着病情进展，食管癌患者胃肠道反应逐渐加重，进食困难，严重影响患者生活质量，同时也限制了后线治疗方案的实施[6]。既往有研究表明，中医中药在降低食管癌放疗及化疗不良反应、协助抗癌治疗、改善进食、延长患者生存时间等方面均取得了很好的效果[7-8]。

中药复方黄连汤(载于《圣济总录》卷一七八)主要由中药单体黄连、乌梅、艾叶和干姜组成，具有平调寒热、和胃降逆之药效，主要用于消化系统疾病[9]。现代研究表明，黄连汤能够保护胃肠道黏膜[10]，对于多种消化系统肿瘤具有不同程度的抑制作用。复方黄连汤中有效成分在食管癌治疗中具有潜在功效和靶点，但目前尚无更多系统性文献报道。本研究通过构建“复方黄连汤-有效成分-靶点-食管癌”网络，以生物信息学分析方法寻找复方黄连汤与食管癌治疗靶点之间的有效联系，探索其分子机制，并用分子对接给予验证，为复方黄连汤治疗食管癌提供科学依据。

1 材料与方法

1.1材料来源 检索中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)及DrugBank、UniProt、GeneCards、OMIM、TTD、PharmGKB等数据库。

1.2方法

1.2.1复方黄连汤有效成分筛选 在TCMSP中分别检索“黄连”“乌梅”“艾叶”“干姜”的活性成分，筛选条件设置为类药性(DL)≥0.18、口服生物利用度(OB)≥30%[11]。将候选化合物在DrugBank中匹配靶点，利用UniProt数据库对药物靶点英文全名进行标准化。

1.2.2黄连汤治疗食管癌潜在靶点筛选 利用GeneCards、PharmGKB、DrugBank、OMIM、TTD数据库检索关键词Esophagus cancer，筛选、下载与食管癌相关的靶标，汇总数据库后去除重复值，获得疾病靶点。

1.2.3“中药-化合物-靶点-疾病”网络构建 对复方黄连汤活性成分的对应靶点及食管癌的靶点蛋白取交集后获得共同靶点，绘制韦恩图，并在Cytoscape3.8.0软件中构建“中药-化合物-靶点-疾病”网络，借以研究复方黄连汤的中药成分。

1.2.4蛋白质相互作用(PPI)网络构建与分析 利用STRING数据库绘制PPI网络，采用Cytoscape3.8.0软件进行网络结构可视化处理。根据Degree值中位数筛选核心靶点[12]。

1.2.5基因富集分析 为探讨中药化合物对应的预测潜在靶点在基因功能和通路中的作用，将1.2.4收集的共同靶点蛋白导入DAVID 6.8数据库,对获得的潜在有效靶点，采用R软件进行基因本体论(GO)和京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析，分析其主要的生物学过程和代谢通路，将结果绘制成柱状图和气泡图进行可视化。

1.2.6分子对接 小分子配体的2D结构文件从PubChem数据库中下载，应用ChemOffice软件将其转换为3D结构文件。从RCSB PDB数据库下载蛋白分子结构文件，采用PyMOL软件删除溶剂分子和小分子。采用AutoDock Tools软件通过调整X、Y、Z坐标轴并进行分子对接模拟，并利用PyMOL软件对其进行可视化。

2 结 果

2.1复方黄连汤有效成分筛选结果 通过TCMSP检索黄连汤的化学成分，获得黄连14个，乌梅8个，艾叶9个，干姜5个，去重后共计30个，对应靶点211个。通过UniProt数据库校正后最终得到183个靶点。

2.2复方黄连汤治疗食管癌潜在靶点筛选结果 共检索到食管癌相关靶点5 965个，其中GeneCards数据库5 332个，OMIM数据库168个，PharmGkb数据库388个,TTD数据库11个,DrugBank数据库66个。利用韦恩图取交集得到5 625个靶点。见图1。进一步分析食管癌相关靶点与黄连汤化学成分相关靶点的相互交集，最终得出药物与疾病共同靶点154个，即为复方黄连汤治疗食管癌的潜在靶点。见图2。

图1 食管癌交集靶点韦恩图

图2 药物与食管癌交集靶点韦恩图

2.3“中药-化合物-靶点-疾病”网络构建情况 网络图见图3，其中有154个食管癌癌靶点基因(图中右侧节点)，节点越大代表与之相连的化合物越多，网络中有22个化合物成分。

图3 “中药-化合物-靶点-疾病”网络图

2.4PPI网络构建与分析情况 PPI网络中共有109个节点，通过307条边发生相互作用。在该网络中，每条边代表靶点之间的靶向相互作用关系。筛选潜在核心目标，创建子网络，见图4。结果显示，JUN、RELA、TP53、TNF、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1 11个基因是复方黄连汤治疗食管癌的潜在关键靶基因。

图4 核心网络图

2.5富集分析情况 GO富集分析确定了2 598个条目，其中生物学过程2 331条，包括对脂多糖、细菌起源分子、金属离子、营养水平的反应等，尤其对脂多糖反应显示出较高的调节能力。细胞成分77条，分别是膜筏、膜微结构域、膜区域、转录因子复合物、RNA聚合酶Ⅱ转录因子复合物、核转录因子复合物、蛋白激酶复合物、小凹、神经元细胞体。复方黄连汤作用区域主要是细胞膜，其次是线粒体和细胞体等结构。分子功能189条，主要包括DNA-结合转录激活因子活性、RNA聚合酶Ⅱ-特异性、组蛋白激酶活性等。取排名靠前的10个条目作图。见图5。

图5 GO富集分析柱状图

KEGG通路富集分析中获得166条通路(P<0.05)，排序后取前30条信号通路(富集基因数目降序排列)作图，见图6。复方黄连汤作用于食管癌的主要靶点集中在脂质和动脉粥样硬化信号通路(39个靶点，占27%)、乙型肝炎信号通路(31个靶点，占21%)、晚期糖基化终产物(AGE)-晚期糖基化终末产物受体(RAGE)信号通路(30个靶点，占20%)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路(28个靶点，占19%)、肿瘤坏死因子信号通路(24个靶点，占17%)等。

图6 KEGG通路富集分析气泡图

2.6分子对接 通过查阅文献从核心基因中筛选与食管癌密切相关的关键基因RELA、TN及JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1，分别与治疗食管癌的有效成分山柰酚、槲皮素进行分子对接，以结合能小于或等于-5.0 kcal/mol作为筛选标准。结果显示，复方黄连汤核心活性成分槲皮素、山柰酚与食管癌关键分子对接结合能均小于-5.0 kcal/mol。

3 讨 论

食管癌属于中医“哽噎”范畴，病因一为饮食劳倦、情志不调；二为外感六淫、秽浊之邪。内外之邪可单独致病，也可交互影响，共同致病，最终导致脏腑功能失调、气血失和、邪气阻滞、日久生癌，辨证多为气郁、痰阻、血瘀、气血津亏。临床发现时多为中晚期，部分患者经常规手术、放疗、化疗等治疗后，气血亏虚更严重，不利于疾病恢复。前期的临床研究发现，中药治疗食管癌作用平稳、不良反应小，尤其在改善食管癌患者生活质量和延长患者生存时间等方面疗效显著。现代药理研究表明，黄连具有保护心脑血管、降糖、抗炎、抗肿瘤等药理作用[13]。陈梅等[14]研究指出，黄连汤主要用于消化系统疾病，以及辨证属上热下寒、寒热错杂者，效果明显。复方黄连汤具有抗氧化、病毒、炎症、细菌，同时具有增强机体免疫等多种作用[15]。

本研究通过网络药理学分析，共筛选出复方黄连汤的有效化学成分30个，对应靶点183个，食管癌相关靶点5 625个，最终得出药物与疾病共同靶标154个；通过PPI网络分析得到网络核心基因11个，分别为RELA、TNF、TP53、JUN、MAPK1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1。上述11个核心基因通过基因ID转换，获得复方黄连汤的活性分子为槲皮素、山柰酚。为了进一步明确复方黄连汤治疗食管癌的作用机制，本研究采用分子对接技术对关键化合物山柰酚与关键蛋白(RELA、TNF)、槲皮素与关键蛋白(JUN、TP53、MAKP1、FOS、MYC、CDKN1A、CCND1、IL6、RB1)进行分子对接。结果显示，山柰酚、槲皮素与靶蛋白均可进行很好地结合。

槲皮素是一种具有潜在化学预防活性的多酚类黄酮，其可上调Bax蛋白及下调Bcl-2蛋白表达，从而诱导食管癌细胞凋亡[16]。这种作用呈剂量依赖性地抑制食管癌细胞增殖、迁移、侵袭、血管生成[17]，LIU等[18]进一步研究发现，槲皮素通过降低血管内皮生长因子A、基质金属蛋白酶2和基质金属蛋白酶9的表达，从而抑制食管癌细胞侵袭和血管生成。WANG等[19]研究发现，槲皮素通过诱导miR-1-3p对食管癌细胞产生抑制作用。槲皮素-3-甲基醚可有效抑制食管鳞状细胞癌中蛋白激酶B(Akt)及下游雷帕霉素靶蛋白表达，减弱食管癌细胞增殖和锚定能力[20]。山柰酚可显著抑制人Ea-109细胞增殖和凋亡[21]，参与调控细胞周期。此外，山柰酚还可明显抑制肿瘤糖酵解和表皮生长因子受体活性，进而抑制肿瘤生长，是治疗食管癌的有效化合物[22]。

本研究结果显示，复方黄连汤治疗食管癌的靶点位于细胞膜，主要信号通路涉及脂质和动脉粥样硬化信号通路、AGE-RAGE信号通路、MAPK信号通路等。脂质过氧化的主要产物4-hydroxynonenal(4-HNE)被认为是一种氧化应激诱导剂。ZHANG等[23]研究发现，食管癌组织中4-HNE的表达水平显著升高，且其表达水平与临床分期和炎症严重程度显著相关，并随着癌前病变的进展而升高，与染色阴性患者相比，4-HNE染色阳性患者临床结局较差。提示氧化应激是食管癌患者癌变的驱动力。有研究发现，AGE-RAGE信号通路通过Rb蛋白磷酸化增强前列腺癌细胞的增殖，其在食管癌中的机制尚不明确[24]。

综上所述，复方黄连汤中药物有效成分山柰酚、槲皮素可能通过MAPK等信号通路发挥抑制食管癌的作用。复方黄连汤治疗食管癌具有多成分、多靶点、多通路特点，为其临床应用提供了基础。本研究应用网络药理学方法，从潜在化学成分、靶标、信号通路、生物学过程等角度分析复方黄连汤治疗食管癌潜在作用机制，为临床提供了理论依据。由于网络药理学的局限性，后续基础研究可围绕预测得到的化合物、作用靶点及信号通路作进一步研究。