芦笋两性株染色体的细胞学研究

李 霞， 包艳存， 李保华， 牛晓雪， 路 远， 牟 萌， 杨 林

(潍坊市农业科学院， 山东 潍坊 261071)

cytological characteristics

芦笋(AsparagusofficinalisL.)学名石刁柏，是百合科天门冬属多年生草本宿根性植物，以嫩茎供食，是国际市场公认的营养保健蔬菜。核型分析表明，天门冬属植物有二倍体、四倍体和六倍体，共同的染色体基数是x=10[1]，普通二倍体芦笋有20条染色体2 n=2 x=20(XY)，其中有10条大染色体、2条中型染色体和8条小染色体，除了小染色体3号为亚中着丝粒染色体外，其他染色体都是中部着丝粒染色体，核型类型属2 B型，较不对称，为较原始的类型[2]。芦笋属于雌雄异株植物，一般芦笋雌株只开雌花，雄株只开雄花，其性别决定主要体现在雌、雄花器官的形态建成上。芦笋性别有3种基因型和4种表现型，分别为雌株(mm)、普通雄株(Mm)、超雄株(MM)、雄性两性株(Mm，简称两性株)，其中超雄株是有活力的[3-4]。芦笋和其他雌雄异株植物一样，不论是雌株还是雄株，最初形成的都是两性花，同时具备雄蕊和雌蕊，在发育过程，雌性或雄性器官发生退化，两性花逐渐发育形成单性花[5]。但自然界中有些芦笋雄株的雌蕊退化不完全而会结出少量果实，形成种子，这样的植株称为两性株，通常情况下芦笋两性株出现的比例仅有0～2%[6]。目前国内仅在芦笋两性株的初步利用、调查、两性花诱导及生理生化等方面做了研究[6-9]，还未涉及对芦笋两性株染色体的研究，故本试验采用常规的细胞学分析方法对芦笋两性株的染色体进行有丝分裂和减数分裂研究，旨在为芦笋两性株的研究增加细胞学资料，为进一步揭示两性株生长发育提供理论基础。

注：A为荷兰全雄两性株单株；B为两性株后代套袋雄株(取此根尖和花蕾)；C为收获的两性株浆果；D为有种皮的两性株种子；E为有种皮和无种皮的两性株种子；F为无种皮的两性株种子。图1 两性株试材Fig.1 Test materials of andromonoecious plants

1 材料与方法

1.1 材 料

以“冠军”父本“荷兰全雄”为原始材料，2018年9月田间调查3 267株制种群体(占地面积6.67 hm2)中雄株单株结种情况，发现有22株雄株结种，将新结种子全部收获，共计2 256粒，观察发现种子的大小、千粒重、饱满度及种皮的有无等均不一致。所有种子于2019年3月育苗，6月定植于潍坊市现代农业科技示范园大棚中，成活植株968株，成活率为42.91%，10月淘汰其中的雌株，剩余雄株418株，单株做标记。2020—2021年连续2年调查两性株后代雄株的生长情况，对其中结种单株用90目纱网套袋，取当年生的根尖和花蕾分别进行有丝分裂和减数分裂研究(图1)。

1.2 方 法

1.2.1根尖染色体有丝分裂观察

采用孚尔根染色法，取套袋两性株当年生的白色根尖，置于蒸馏水中于0 ℃处理24 h后，加入新配制的卡诺氏固定液Ⅰ(V乙醇∶V冰乙酸=3∶1)保存于4 ℃冰箱内，根尖用1 mol/L盐酸60 ℃解离10 min，Schiff试剂染色，1%醋酸洋红常规压片，Olympus BX 41显微镜观察，挑选处于分裂中期形态良好的细胞在100倍的油镜下拍照，对50个染色体中期分裂相好的制片进行统计分析。计算染色体数目、相对长度、臂比等[10]，确定染色体核型[11]。

1.2.2花粉母细胞减数分裂观察

采用改良苯酚品红染色法，取套袋两性株0.5 mm左右的花蕾，蒸馏水冲洗2～3次，在卡诺氏固定液Ⅰ中固定24 h，然后转移到70%酒精中于4 ℃冰箱保存备用。1%醋酸洋红解剖制片，改良石炭酸品红复染，酒精灯上微烤后压片。对85个处于中期Ⅰ的细胞用Olympus BX 41显微镜观察拍照并进行分析。

2 结果与分析

2.1 芦笋两性株的根尖有丝分裂

对50个中期分裂相好的细胞进行统计分析，结果表明，芦笋两性株的染色体数目为20条，20条染色体中包括8条中部着丝粒染色体，分别是第6、7、9、10号染色体；12条近中部着丝粒染色体，分别是第1、2、3、4、5、8号染色体；其中第8号染色体带有随体。最短的染色体是第10号，相对长度为6.14%，最长的染色体是第1号，相对长度为16.42%，染色体的长度比为2.67，介于2∶1～4∶1之间；臂比大于2∶1染色体占比为30%，介于1%～50%之间，核型属于2 B型，核型公式为2 n=2 x=8 m+12 sm(2 SAT)(表1、图2、图3)。

注：A为棒状二价体和环状二价体；B为全部为环状二价体；C为中期Ⅰ，箭头示小环状二价体；D为中期Ⅰ，箭头示配对不完全的二价体；E为中期Ⅰ，箭头示染色体粘连；F为中期Ⅰ，箭头示环状四价体；G为落后染色体-箭头示；H为染色体桥-箭头示。图4 芦笋两性株花粉母细胞减数分裂Fig.4 The meiosis of pollen mother cells of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

表1 芦笋两性株的核型参数Table 1 Karyotype parameters of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

2.2 芦笋两性株的花粉母细胞减数分裂

对85个花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ观察结果显示，所有细胞中，中期Ⅰ同源染色体配对过程中二价体出现的比例为97.65%，四价体为2.35%；二价体中96.39%是棒状二价体和环状二价体共存，6.02%为环状二价体；减数分裂过程中有50%的细胞均存在一对较小的环状二价体；中期Ⅰ出现了配对不完全的二价体和染色体粘连的现象。在由中期Ⅰ向后期Ⅰ转变的过程中出现了落后染色体和染色体桥(图4)。

图3 芦笋两性株的核型模式Fig.3 Karyotype models of andromonoecious plants of Asparagus officinalis L.

3 讨 论

本研究观察到芦笋两性株体细胞染色体数目和花粉母细胞染色体数目均为2 n=2 x=20，这与林俊芳,庄伟建[12]，周劲松等[14]的研究结果一致，但随体的位置及数量、染色体臂比、核型类型存在差异[12-14]。分析原因，一是在芦笋进化早期，性别决定并未发生，此时具有两性特征，当雄花的雌性器官或者雌花的雄性器官停滞发育时，此时由两性逐渐向单性分化，由于发育阶段的不同致使体细胞有丝分裂出现了不同；二是取材位置不同，先前的研究试材都是生长旺盛的茎尖，本研究的试材是两性株当年生的白色根尖。

国内外对芦笋两性株的花粉母细胞减数分裂研究较少，本研究发现，花粉母细胞减数分裂中期Ⅰ出现了棒状和环状的构型，环状四价体出现的频率为2.35%，在观察的细胞中有一半存在一对较小的环状二价体。观察到绝大多数芦笋两性株花粉母细胞减数分裂中染色体的行为正常，在少数的花粉母细胞减数分裂中出现了配对不完全的二价体、染色体粘连、落后染色体及染色体桥等异常行为，异常行为的出现可能导致芦笋两性株一部分花粉败育而不结实。分析原因，除了两性株与普通芦笋群体在进化上有一定差异及两性株花药自身发育的情况外，可能在取材时外界环境干扰了不同材料的正常发育，导致不同的减数分裂现象出现。随着染色体分带、荧光原位杂交及各种分子技术的出现，芦笋两性株染色体配对研究的准确率大大提高。