酸枣种子生物学特性研究

武延生, 滑梦玉, 贡江燕, 董晓霞, 李 欢, 曹 萌, 王僧虎

(邢台学院生物科学与工程学院， 河北 邢台 054001)

germination rate

酸枣(Ziziphusjujubavar.spinosa)耐旱能力强[1]，在我国北方地区资源储量较大，太行山区约48.1%的地域为酸枣适生区[2]，据统计，在河北省域内约有36万hm2野生酸枣。酸枣在我国已有2 000余年的开发利用历史，酸枣全株各组织器官皆有巨大的经济开发价值，果实和种子开发已转化为可观的经济效益[3]。可通过培育根蘖苗或实生苗进行人工繁殖，但由于根蘖苗材料较少，在生产中已逐步放弃，实生苗培育面临着成活率低、培育成本高的问题。开展酸枣种子生物学研究可从根本上解决种子繁殖效率低的问题，积极发挥实生苗培育在酸枣生产中的作用。目前关于酸枣种子生物学特性的研究报道不多，对酸枣种子生物学特性研究不够系统、深入，对影响酸枣种子发芽的因素调查不够全面。本研究对酸枣种子表型进行了深入细致的观察，对影响酸枣种子发芽的因素进行了多方面的考察，初步探明了酸枣种子发芽机制，为深入探究酸枣种子生理机制提供较为全面的观察资料，为开发高效酸枣实生苗培育技术提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料、仪器设备

1.1.1实验材料

酸枣种子采于邢台学院酸枣实验基地及附近野生地区，选择表面光滑、无裂痕的当年采收种子用于实验。

1.1.2仪器、设备

数码相机(Olympus tough，TG-5)、电热鼓风干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)、生化培养箱(宁波艾德生仪器有限公司)。

1.2 实验方法

1.2.1种子形态结构观测

用数码相机拍照，对细小结构采用微距和景深合成功能成像。观测酸枣果核内部房室结构时采用平口钳固定酸枣果核，用细齿锯锯开果核。

1.2.2种子含水量测定

取酸枣种子500粒，随机分成5组，每组100粒。参照于旭东等[4]的方法，将酸枣种子置于(105±0.1)℃电热鼓风干燥箱中，间隔一定时间称重一次，在分析天平上称重，烘至恒重。

1.2.3种子吸水率测定

将酸枣种子用纱布包裹，浸入蒸馏水中，水温21～24 ℃，称重前用吸水纸吸干种子表面水分，浸泡6 h后第一次称重，之后每隔12 h称重一次，直至重量不增加。实验分别考察种皮完整(I)、种皮剥除(S)和种子刺破(P)3种条件下的吸水情况。种皮剥除方法是用解剖刀剥除，保持内部结构完整、无机械损伤。种皮刺破方法是用锥子于种体中间垂直刺入，横穿子叶，使一侧有孔，另一侧完好，孔径1 mm。吸水率计算公式为，吸水率(%)=[(吸水后质量-吸水前质量)/吸水前质量]×100%。

1.2.4种子发芽率测定

在培养皿底部铺上1～2层滤纸，用蒸馏水浸透，在滤纸上平放酸枣种子，密封保湿，置于生化培养箱内培养，温度25 ℃，每24 h 观察一次。种子萌发以胚根突破种皮露白为准。

1.2.5种子老化处理

参考文献[6]的方法并加以改进，取酸枣种子500粒，随机分成5组，每组100粒，将酸枣种子表面打湿置于密封袋内，不得使种子浸入水中，使湿度保持100%，温度40 ℃，分别处理0 d、2 d、4 d、6 d、8 d。将老化处理后的种子表面洗净后，置于20～25 ℃阴凉通风处，阴干。

2 结果与分析

2.1 酸枣种子基本特性

酸枣种子位于核壳的子房室内，核壳为内果皮。核壳较厚，幼胚不易撑破核壳，带核壳发芽率(41.7±5.8)%。子房一般由2心皮发育而成，偶见由3心皮发育而成，分别形成2室和3室。每个子房室内最多含有1粒种子。根据子房内种子数目，分为单仁种子、双仁种子和三仁种子，单、双仁种子常见，三仁种子罕见。酸枣种子呈扁心形，高(6.11±0.63)mm、宽(4.85±0.52)mm、厚(2.80±0.29)mm，质量为(0.041 3±0.009 9)g。酸枣种子分内外两侧，双仁种子内侧平坦，有纵棱(脐条)，外侧凸出，而单仁种子的内外两侧近似，均凸出(图1 A、B)。根据酸枣种子在核壳内的位置，分为上下两端，上端平滑，下端形状不规则，略尖，种脐和发芽口集中于种子下端(图1 D)。鉴于种脐和发芽口紧密排列，同时又有明显脐条结构，由此可以判断酸枣种子由倒生胚珠发育而来。酸枣种皮光滑，有光泽，革质，厚约0.2 mm，种皮表面常见平滑凹坑(图1 B、C、D)。种皮颜色多样，深浅不同，颜色各异，由黄色经由紫红色直至褐色，呈过渡性变化(图1 E)。将酸枣种子按照黄色、紫红色和褐色分为3类，粒数比例约为6∶12∶1，质量比例与之相同。野生酸枣种子质量差异较大，分布在0.015～0.053 g之间。

将酸枣种子解剖后，发现酸枣种子共有3种结构，除了种皮和胚外，还存在明显的胚乳。胚乳呈乳白色，片状，在上部结合，结合部分为圆形、紫褐色，由上而下包裹住大部分子叶，但未掩盖胚芽(图1 F、G)。子叶硕大，表面分布叶脉(图1 H)。胚乳与胚的质量比约为1∶2，但此比例不恒定，变异较大。

酸枣种子经干燥处理后，种皮变黑，种皮皱褶增加，有种皮脱落现象(图2 B)。烘干至36 h时，重量不再减少，含水量为(8.26±0.12)%(图2 A)。萌发处理后，干燥处理后的种子不能萌发。

2.2 酸枣种子吸水性测定

为了考察种皮在酸枣种子吸水过程中的作用，将种皮分别进行了刺破(p)和剥除(r)处理，以完整种皮(i)为对照。研究结果显示，p处理和r处理的吸水率较i处理明显升高(图3 A)。总体来看，在三种处理条件下，种子吸水率均不是恒定的，可分为快速吸水期、慢速吸水期和饱和期3个阶段。在快速吸水期，三者差异明显，所需时间和吸水率分别是：12 h、(55.47±4.43)%(i)，6 h、(52.00±5.24)%(p)和6 h、(68.18±4.39)%(r)。三者相比，p处理和r处理后，快速吸水期明显缩短，由12 h 缩短至6 h。在慢速吸水期，三者持续时间和吸水率分别是：52 h、(82.50±5.21)%(i)，18 h、(77.69±4.91)%(p)，18 h和(88.64±5.13)%(r)。三者相比，p处理和r处理缩短吸水时间，由52 h缩短至18 h，吸水率达到顶峰。表明种皮对种子吸水具有很大的阻碍作用。在饱和期，酸枣种子质量略有下降，分别下降了(10.18±2.43)%(i)、(3.72±2.19)%(p)和(5.13±2.51)%(r)。三者相比，完整种子下降幅度最大。实验数据暗示，酸枣种子在浸泡处理中可能发生了呼吸作用，由此造成种子质量下降，完整种皮为种体内部结构提供了较好的保护屏障，呼吸效率较高，而p处理和r处理破坏了种皮的保护作用，在一定程度上妨碍了酸枣种子呼吸作用的正常进行。此外，浸泡处理后，种皮颜色加深成为褐色(图3 B)。

注：A为核壳内的酸枣种子；B为酸枣种子内(i)外(o)两侧；C为酸枣种子上下两端；D为酸枣种子在核壳内的位置；E为酸枣种子表皮颜色类型；F为去除种皮的酸枣种子；G为酸枣种子胚乳；H为酸枣种子胚。图1 酸枣种子形态结构Fig.1 Morphological structure of wild jujube seeds

注：A为酸枣种子千粒重随干燥时间的变化过程；B为干燥处理的酸枣种子(d)与对照(c)的比较。图2 酸枣种子干燥过程Fig.2 Drying process of wild jujube seeds

为了进一步探究酸枣种子不同部位的吸水速率，分别将酸枣种子按照侧面浸水(l)、上端浸水(t)、下端浸水(b)3种方式放置，考察酸枣种子萌发情况。平放是将酸枣种子平放于培养皿内用蒸馏水浸湿的滤纸上，是进行酸枣培养时所采用的通用放置方式。后两种方式是用手术刀在厚度为0.6 cm的泡沫上扎孔，将酸枣种子竖直置于其中并贯穿泡沫，置于培养皿内，培养皿内放水，使酸枣种子上端或下端浸入水中0.05～0.10 cm。研究结果显示，三种处理条件下发芽率差异显著，在萌发第6天时，三者发芽率分别为(81.30±4.52)%(l)、(27.43±3.35)%(t)、(54.86±4.8)%(b)(图3 C)。表明酸枣种子下端吸水率高于上端，这可能是由于酸枣种子下端存在种脐、发芽口，二者的吸水速率高于种皮部位，而对于l处理，由于其与培养皿表面接触面积大，吸水速率也相对较高所致。

2.3 种皮及其颜色、胚乳和种体大小对酸枣种子发芽的影响

种胚是发芽部位，种皮、胚乳发挥支持作用，为了考察种皮、胚乳在发芽过程中的作用，对酸枣种子做了两种处理，分别是剥除种皮(r)和同时剥除种皮、胚乳只剩种胚(e)，以完整种子(i)为对照。发芽率统计结果显示，r、e处理使启动发芽时间提前，萌发2 d时，r、e处理的发芽率分别为(21.0±1.9)%和(10.1±2.3)%，而对照(i)仅为(1.9±0.7)%；发芽率明显提高，培养到第5天时，r、e处理的发芽率分别是(80.9±5.1)%和(91.2±4.3)%，明显高于对照(73.1±2.7)%(i)(图4 A)。表明胚乳、种皮对胚根生长均有一定抑制作用，种皮的抑制作用更加明显。

下胚轴和胚根生长观察结果显示，i处理使胚根快速生长，生长速率远高于对照；e处理使胚根生长启动萌发较早，但生长缓慢(图4 C、D)。表明胚乳通过提供营养使胚根持续生长，种皮除了阻碍胚获取水分外，还有可能分泌抑制胚根生长的物质。

为了进一步探究酸枣种皮水溶性浸出物对白菜(Brassicapekinensis)种子发芽率的影响，参考杜会聪等[5]的方法进行并适当调整，分别将20粒和50粒酸枣种子的完整种皮磨碎后置于10 mL蒸馏水中，在4 ℃条件下浸泡24 h，滤去不溶物，以浸提液培养白菜种子。研究结果显示，酸枣种皮浸出物对白菜种子有一定的抑制作用，培养3 d时，20粒和50粒种子种皮浸出液培养的白菜种子发芽率分别为对照的(90.48±5.32)%和(79.76±4.91)%(图4 B)。表明酸枣种皮的水溶性物质中含有抑制种子萌发的成分。

野生酸枣种子种皮颜色差异较大，选择差异较为明显的黄色、紫色和褐色3类种子进行了发芽实验。研究结果显示，三种颜色种子的发芽现象差异较为明显，黄色与紫色种子的发芽率和胚根生长较为接近，而二者与褐色种子相差较远，黄、紫两色种子的发芽率明显高于褐色种子，其下胚轴和胚根生长长度也明显高于褐色种子(图5)。表明三种种皮颜色的种子其生活力存在明显差异。

野生酸枣种子质量差异较大，为了探究种体质量与发芽率之间的关系，将种子分为大(0.05～0.06 g)、中(0.03～0.04 g)和小(0.02～0.03 g)3类种子进行发芽实验。结果显示，3类种子的发芽情况差异较为明显，表现在3个方面：启动发芽时间不同，小种子培养1～2 d即有发芽现象，中种子培养2～3 d有发芽现象，大种子则在培养3～4 d后，才能观察到明显的萌发现象；发芽率不同，在培养第9天时，大中小3类种子的发芽率分别为(68±4.6)%、(91±5.9)%和(81±5.2)%(图6 A)；胚根生长长度不同，在培养第11天时，大中小3类种子的胚根长度分别为(87.1±6.3)mm、(113.6±8.9)mm和(107.1±7.7)mm(图6 B)。表明大中小3类种子生活力存在明显差异，中小种子生活力明显高于大种子。

2.4 老化处理对酸枣种子发芽的影响

酸枣种子老化处理后，出现不同程度的发霉现象，随着老化时间延长，霉变程度相应加深(图7 B)，在老化8 d时，霉变程度陡然升高，达到69%(图7 A)。老化处理对发芽率影响明显，表现在2个方面：随着老化处理时间延长，发芽率逐步降低，老化0 d、1 d、2 d、3 d、4 d的发芽率依次为(88.4±3.4)%、(71.5±3.1)%、(70.2±2.7)%、(60.0±3.1)%和(6.5±1.1)%；老化处理使酸枣种子发芽时间提前，老化处理2 d、3 d的种子在萌发第3天时，发芽率达到(37±3.8)%和(44±4.7)%，远高于对照的(22±3.3)%(图7 C)。表明老化处理加速了酸枣种子成熟，同时也对酸枣种子的生活力造成了负面影响。

2.5 不同培养条件对酸枣种子发芽的影响

以含有不同浓度聚乙二醇(PEG)的溶液模拟不同的干旱条件，分别设置了0%、5%、10%、15%和20%的PEG溶液培养酸枣种子，培养12 d后，发芽率达到最高，分别为(72.5±6.3)%、(40.8±5.9)%、(34.5±4.7)%和(11.5±4.1)%(图8 A)。表明随着PEG浓度升高，发芽率逐步下降。

注：A、C为酸枣种子分别在i、r和e 3种状态下的发芽率(A)和下胚轴、胚根生长长度(C)；B为分别用不同浓度酸枣种皮浸出物培养的白菜种子的发芽率；D为酸枣种子分别在i、r和e 3种状态下的下胚轴和胚根生长情况。图4 种皮、胚乳对酸枣种子发芽的影响Fig.4 Effects of seed coat and endosperm on wild jujube seed germination

图5 不同种皮颜色对酸枣种子发芽率(A)和下胚轴、胚根生长长度(B)的影响Fig.5 Effect of different colors of seed coat on germination rate (A) and length of hypocotyl and radical (B) of wild jujube seeds

在低温(10 ℃)和高温(40 ℃)条件下，酸枣种子无萌发迹象。在15～35 ℃范围内，随着温度升高，发芽率表现为“低-高-低”的变化趋势，25 ℃发芽率最高，为(83±7.4)%。在25 ℃随着培养温度逐步降低，最高发芽率逐步降低，达到最高发芽率所需时间也逐步延长；在25 ℃随着培养温度逐步升高，最高发芽率逐步降低，达到最高发芽率所需时间逐步缩短(图8 B)。

分别以含0%、12.5%、50%和100%的MS溶液为培养基培养酸枣种子，培养到第8天时，在各培养基中发芽率均达到最高，分别为(83.6±5.1)%、(82.5±4.3)%、(74.8±4.7)%、(22.0±3.2)%(图8 C)。结果显示，在培养基中，随着MS盐浓度的升高，酸枣种子发芽率逐步下降，这表明酸枣种子在发芽过程中不需要施加营养盐。

图6 酸枣种子种体大小对发芽率(A)和下胚轴、胚根生长(B)的影响Fig.6 Effects of seed body size on germination rate (A) and growth of hypocotyl and radicle (B) of wild jujube seeds.

注：A、B为不同老化处理时间对酸枣种子霉变率及霉变情况的影响；C为不同老化处理时间对酸枣种子发芽率的影响。图7 不同老化处理时间对酸枣种子状态和发芽的影响Fig.7 Effects of different aging treatment time on wild jujube seed state and germination

分别以含0 mmol/L、50 mmol/L、100 mmol/L和200 mmol/L葡萄糖的溶液为培养基培养酸枣种子，培养到第8天时发芽率达到最高，分别为(83.9±6.1)%、(65.3±5.1)%、(57.68±4.9)%和(13.11±4.3)%(图8 D)。结果显示，随着葡萄糖浓度升高，发芽率逐步下降，这表明酸枣种子在发芽过程中不需要施加葡萄糖。

将培养酸枣种子的培养皿用黑色摄影布包裹3层，严禁外界光线进入，以未用摄影布遮盖培养的酸枣种子为对照。结果显示，光照条件下的最高发芽率[(92.1±4.7)%]显著高于黑暗条件下的发芽率[(78.2±4.4)%](图8 E)，差异显著(t检验，p<0.05)。表明光照对酸枣种子发芽有一定的促进作用。

分别以Tris和MES配制pH值为3、4、5、6、7、8、9、10、11不同酸度溶液培养酸枣种子。结果显示，在pH值为8时，发芽率最高，达(92.3±5.6)%，其次为pH 7时的发芽率，为(86.1±4.8)%。随着酸度向两侧延伸，发芽率逐步下降，在pH 3时，发芽率为(4.2±1.6)%，pH 11时的发芽率为0(图8 F)。表明酸度对酸枣种子发芽有明显的影响，在中性及偏碱性条件下较适宜酸枣种子发芽。

3 讨 论

3.1 酸枣种子表型特征研究

本研究对酸枣种子形态特征进行系统观察，酸枣种子由倒生胚珠发育而来，种脐与发芽口集中于种体下端，种子整体形状呈扁心形，由外而内依次含有种皮、胚乳和胚3部分结构(图1 F、G、H)，胚乳所占比例较大，约为果体总重的1/3，子叶硕大，符合鼠李科枣属的一般特征[7]。种体含水量为(8.26±0.12)%(图2 A、B)，含水量偏小，属于油料作物种子[8]。野生酸枣种皮颜色差异较大，可分为黄、紫红和褐色3种基本颜色，其中紫色种子所占比例最高，约占63%。野生酸枣种子质量差异较大，分布在0.015～0.053 g之间，平均(0.041 3±0.009 9)g。

3.2 酸枣种子发芽的影响因素

酸枣种子发芽能力与种体自身状况(种皮以及种皮颜色、胚乳、种体大小和老化状态)和外界条件(水分、温度、光照和酸度)关系密切。

注：A、B、E和F分别表示不同水分(A)、温度(B)、MS盐浓度(C)、葡萄糖浓度(D)、光照(E)和酸度(F)培养条件对酸枣种子发芽率的影响。图8 不同培养条件对酸枣种子发芽的作用效果Fig.8 Effects of different culture conditions on germination of wild jujube seeds

在本研究中发现，种皮本身以及种皮颜色均影响酸枣种子发芽。首先，酸枣种皮作为一种机械结构，对种子吸水有一定的阻碍作用(图3 A)，但这种阻碍作用不是完全消极的，本研究表明，种皮有助于酸枣种子在吸水过程中促进种子成熟。酸枣种皮各部位的吸水能力不是完全均一的，在种脐与发芽口集中分布下端区域吸水能力最强(图3 B)。其次，酸枣种皮中的水溶性物质对酸枣种子发芽有抑制作用(图4 A、B)。种子内普遍含有发芽抑制性物质，报道显示多数种子的抑制性物质位于种仁[5,9]，本研究的酸枣种子的抑制性物质在种皮中以水溶性形式存在。第三，酸枣种皮颜色与种子发芽率关系密切，表现为“种皮颜色越深，发芽率越低”的趋势(图5 A)。在本研究中发现，酸枣种皮颜色与干燥脱水处理(图2 B)、水中浸泡处理(图3 B)、老化处理(图7 B)正相关，这些数据暗示，种皮颜色变深可能与种皮老化存在密切的正相关关系。酸枣胚乳在胚胎发育中发挥重要作用，这可从两方面证据进行佐证：酸枣胚乳体积硕大；去除胚乳，胚胎发育受到抑制(图4 A、C、D)。种子大小与种子发芽率之间存在着微妙的关系，种子质量显著高于平均质量的种子，其活力低于质量中等或偏小型的种子。

本研究结果表明，酸枣种子发芽喜水(图8 A)，但不喜无机盐、葡萄糖等营养物质(图8 C、D)，适宜发芽温度为25 ℃(图8 B)，喜中性偏碱条件(pH值7～8)(图8 F)，光照对种子发芽有一定的促进作用(图8 E)。酸枣种子发芽所需条件与酸枣种子结构特点和酸枣所生活的自然环境有着密切的内在联系。酸枣在我国主要分布在中部地区，属于温带气候，土壤酸度为中性偏碱性，春季干燥少雨，光照充分，春季温度与酸枣种子适宜萌发温度接近。酸枣种子发芽所需的温度、酸度、光照等条件显示，酸枣在多年的进化中，已经较好地适应了当地的环境条件。酸枣种子硕大的胚乳与幼苗突破厚密的核壳障碍(图1 A)需要巨大的能量存在着密切的内在联系，胚乳内营养物质的分解与酸枣种子对水的强烈需求，以及酸枣种子对无机盐和葡萄糖等营养成分的拒绝具有密不可分的关系。