巢式一实时荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBVcccDNA的实用性评估

杨慧慧

【摘要】 目的 评估巢式-实时荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的实用性。方法 利用巢式-实时荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者肝组织和PBMC中HVB cccDNA水平。结果 20例血清HBV DNA均为阳性的慢性乙型肝炎患者肝组织和外周血PBMC中ccDNA阳性率分别为55%（11/20）和45%（9/20），两者的符合率为90%。结论 利用巢式-实时荧光定量PCR法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA能较真实地反映HBV的复制。该方法可能是一种评价抗病毒药物的疗效，观察乙型肝炎患者病情的变化的有效手段，具有很强的实用性。

【关键词】 肝炎病毒，乙型；DNA，环状；聚合酶链式反应；单核细胞

【中图分类号】R51216 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949（2015）02-0048-02

乙型肝炎病毒（HBV）复制有其独特的地方，首先形成共价闭合环DNA（covlently closed circular DNA，cccDNA），然后转录成前基因组RNA，最后在逆转录酶的作用下合成病毒基因组DNA，故cccDNA是HBV复制的突出标志[1]。cccDNA主要存在宿主的细胞核，既往均采用肝组织检测DNA，但取材困难，限制了临床应用。研究发现外周血淋巴细胞同样存在HBV感染复制现象[2，3]，故检测外周血HBV cccDNA同样能反映HBV复制状况及评价药物疗效，且比肝组织更方便，只是外周血cccDNA浓度较低，易出现假阴性。为了评估巢式-实时荧光定量PCR法在检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HVB cccDNA的实用性，笔者拟利用巢式-实时荧光定量PCR法同时检测慢性乙肝患者肝组织和PBMC中HVB cccDNA的含量，以期为临床检测HCV复制状况及评价药物疗效提供简便有效的方法。

1 材料与方法

1.1 标本 选取长沙市第一医院传染科确诊的慢性乙型肝炎患者20例，男13例，女7例，平均年龄46.8岁（28～65岁），所有患者均未进行任何治疗。每例病例分别采取全血10ml和行肝穿刺获取肝组织；全血采用密度梯度离心法分离PBMC，洗涤5次后检测上清液中HBV DNA，确认HBV DNA PCR结果为阴性后，计数细胞，取1×106细胞备用。肝组织用生理盐水清洗4次，入液氮保存备用。aywHBV全序列的pcp10质粒，采用p-GEM-T-Easy载体构建，用作检测HBV cccDNA的阳性参照定量标准品，提取阳性标准质粒，测定核酸浓度，倍比稀释为5.0×102～5.0×109拷贝/ml，作为阳性标准品对照。

1.2 引物与探针的设计及合成 根据HBV cccDNA与松弛结构DNA（rcDNA）结构上的差异，跨HBV DNA双链缺口两侧选择区域设计2对内外引物，并在负链缺口下游设计TaqMan荧光探针。所有设计的引物能选择性地扩增HBV cccDNA，而不能扩增rcDNA。P1引物：5-CGC TTT CGG GTC CCT CAT GCG ACG TGC-3，P2引物：5-TCG CTT TCG GGT CCC T-3，P3引物：5-GCA CCT CTC TTT ACG CGG TC-3，P4引物：5-AAC TGA AAG CCA AAC AGT G-3，TaqMan荧光探针：5-FAM-CTC TGC C-TAA TCA TCT CAT GTT CAT-TAMRA-3，外引物扩增片段为385bp，内引物扩增片段为105bp。

1.3 主要试剂 基因组提取试剂盒、HBV DNA荧光定量PCR检测试剂盒、质粒抽提试剂盒均购自北京索奥生物技术公司，CR Master Mix试剂购自日本东洋坊公司。

1.4 DNA抽提 利用质粒抽提试剂盒按说明书操作提取PBMC及肝组织中病毒DNA。

1.5 巢式-实时荧光定量PCR扩增 取纯化模板2μl，用外引物进行第一轮常规PCR扩增。外引物P1和P2浓度为10μmol/L，各1μl，10mmoldNTP 0.5μl，Taq酶0.5μl，10×buffer 2μl，ddH2O 13μl；循环条件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃ 5min。第二轮反应用内引物和荧光探针对第一轮PCR产物中的目的片段进行实时荧光定量扩增。反应体系为：第一轮PCR产物2μl，2×Taq PCR Master Mix 12μl，P3、P4引物各1μl，10μmol/L荧光探针0.5μl，反应总体积20μl；循环条件：94℃ 5min；94℃ 30s，50℃ 30s，72℃ 30s，40个循环；72℃ 5min。设阳性标准品对照为aywHBV全序列的pcp10质粒，阴性对照为3例健康献血员。

2 结 果

2.1 肝组织和外周血中PBMC中cccDNA检测结果 第一轮PCR产物电泳在385bp处见阳性条带，第4，6，7，8，10，12，13泳道呈阳性（图1）。20例血清HBV DNA均为阳性的慢性乙型肝炎患者肝组织中ccDNA阳性者10例，阳性率为50%（10/20）。cccDNA定量值为4.214×104～5.211×105拷贝/ml。外周血PBMC中cccDNA陽性者9例，阳性率45%（9/20）。cccDNA定量值为3.521×103～3.452×104拷贝/ml。3例健康献血员PBMC中cccDNA均阴性。

2.2 外周血PBMC和肝组织中cccDNA阳性的符合率 9例外周血PBMC中cccDNA阳性患者的肝组织中cccDNA均阳性，但有1例肝组织中cccDNA阳性患者其外周血PBMC中cccDNA阴性，外周血PBMC和肝组织中cccDNA阳性的符合率高达90%（9/10）。

2.3 方法的敏感性 检测pcp10阳性参照定量标准品，得到该方法的灵敏度为2log10拷贝/ml范围，随着模板量减少，对应CT值增大，呈线性相关，获得标准曲线（图2）。

3 讨 论

临床上一般以HBV DNA载量作为抗病毒治療依据及判断乙肝病毒复制活力，HBV DNA包括rcDNA和ceeDNA。有学者认为单纯依靠血清HBV DNA检测是不够的，应结合HBV cccDNA的检测和临床来进行综合分析，才能更真实地反应患者体内乙肝病毒的复制，为临床治疗提供更为可靠的依据[4]。cccDNA的清除预示着HBV在宿主体内生命周期的终结，因此不少学者认为这是最佳的抗病毒参考指标之一[4]。HBV cccDNA的检测能够评价抗病毒药物的疗效，连续观察更能反映乙型肝炎患者病情的变化，所以准确、方便、快速检测cccDNA的量是目前乙肝治疗的迫切要求。乙型肝炎病毒HBV cccDNA研究以肝组织为多，但肝组织取材困难，临床应用受到了极大的限制。HBV可以感染白细胞，而这种免疫细胞的感染有利于病毒免疫逃逸，不被免疫细胞攻击，从而导致机体清楚HBV能力下降，故外周血PBMC中存在HBV感染和复制，检测外周血PBMC中cccDNA应该亦能反映HCV的复制，但血液中cccDNA的水平远远低于肝组织，检测亦较为困难。

巢式-实时荧光定量PCR技术具有高灵敏性和高特异性，能够检测极其微量的DNA。cccDNA有共价、闭合、超螺旋双链DNA结构，在碱变性后可再复性，而rcDNA是有缺口的双链DNA，碱变性后不可复性 所以本实验方法应用质粒提取试剂盒抽提肝组织和PBMC中的病毒DNA可以祛除rcDNA、单链DNA和RNA，对cccDNA进行纯化，可进一步提高cccDNA检测的灵敏性和特异性[5]。

本研究结果显示，利用巢式-实时荧光定量PCR技术对20例血清HBV DNA阳性的慢性乙型肝炎患者的肝组织和PBMC中的cccDNA进行检测，发现肝组织和PBMC中cccDNA的阳性率分别为50%和45%，且两者的符合率高达90%，表明利用巢式-实时荧光定量PCR技术检测外周血PBMC中的cccDNA亦能较真实的反映HBV的复制，可以避免由于肝组织取材带来的限制，且准确、方便、快捷，是一种评价抗病毒药物的疗效，观察乙型肝炎患者病情的变化的有效手段，具有很强的实用性。

参考文献

[1]陈延平. 检测HBVcccDNA的巢式-实时荧光定量PCR方法的建立及初步应用[D].第四军医大学，2007.

[2]陈勇. 实时荧光定量PCR检测HBV cccDNA体系建立及临床应用初步研究[D].重庆医科大学，2008.

[3]陈延平，孟存英，徐光华，冯继红，王平忠，白雪帆. 应用巢式-实时定量PCR方法检测慢性乙型肝炎患者PBMC中HBV cccDNA[J]. 肝脏，2011，05：401-404.