沙棘果汁对体外培养的阴道毛滴虫作用效果研究*

刘思凡 杨津仲 杨雯 刘君

（海南医学院基础医学与生命科学学院免疫学教研室，海南 海口 571199）

阴道毛滴虫（Trichomonas vaginalis）是全球最常见的非病毒性性传播疾病的病原，可感染人体泌尿生殖系统，多数感染者不会呈现明显的临床症状，甚至没有症状而呈带虫状态，但感染后可引起非典型性盆腔炎、受精率降低、早产、新生儿体质量偏低，罹患前列腺癌和宫颈癌的风险增加及感染HIV 等病原体的感染几率上升[1-3]，是一种不容忽视的寄生虫。阴道毛滴虫对临床常用的药物甲硝唑产生抗药现象被广泛报道[4]，需要寻找其他有效的药物进行治疗。

沙棘（Hippophae rhamnoidesL.）隶属胡颓子科沙棘属，主要分布在中国、印度等，是种富含多种营养物质的药食两用植物[5,6]，它的果实、种子、叶片及其提取物均可入药，含有多种维生素、脂类、酚类化合物、类胡萝卜素、生育酚和植物甾醇等药用成分[7]，种子和浆果油可用于预防和治疗胃溃疡[8]、心血管疾病[9]、特应性皮炎[10]和抗抑郁[11]等，沙棘果粉[12]及沙棘油[13]已被证实对阴道毛滴虫具有杀灭作用，但尚无沙棘果汁的相关研究，本文旨在研究沙棘果汁对体外培养的阴道毛滴虫的杀灭作用。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 沙棘本研究所用的沙棘果实采摘于新疆伊犁天山峡谷野生沙棘林，经鉴定该沙棘种类为中亚沙棘[14]。据其果实的成熟程度将其分为成熟组和未成熟组2 组。

1.1.2 阴道毛滴虫虫株实验用虫株为阴道毛滴虫临床分离株，经药敏检测为甲硝唑敏感株。

1.1.3 主要仪器和试剂GHP9050 型电热恒温培养箱（上海-恒科学仪器有限公司）；显微镜（OLYMPUS）；RPMI-1640 培养基（Hyclone）；小牛血清（四季青）；甲苯胺蓝（上海化学试剂采购供应站分装厂）；血球计数板（上海求精生化试剂仪器有限公司）；细胞培养管；台式低速离心机（江苏省金坛市医疗仪器厂）；青链霉素双抗（Gibco）。

1.2 方法

1.2.1 沙棘果汁的制备沙棘果实采摘后经挑选，除去破损变质的果实及叶片、果梗等杂质，流水冲洗后晾干表面水分，用榨汁机将其果汁榨出，经滤纸过滤，制得沙棘果汁的原汁，保存在4 ℃冰箱。

1.2.2 阴道毛滴虫的体外培养将阴道分泌物中分离的虫株接种至RPMI-1640 培养基中，传代培养，待虫体密度达到一定密度时进行实验研究。

1.2.3 虫体死活的鉴定以甲苯胺蓝染液作为指示剂，在显微镜下可观察到活虫不被着色，死虫被染成蓝色。

1.2.4 沙棘果汁作用部位将纯的沙棘果汁与阴道毛滴虫按一定比例混合至果汁终浓度分别为10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%，滴加50 μL混合液与1 μL 5%的甲苯胺蓝染液迅速混匀，镜下观察，计时，重复3 次。对死亡的虫体进行扫描电镜和透射电镜观察从而判断沙棘果汁作用部位。

1.3 统计学方法通过GraphPad.Prism（V8，GraphPad Software Inc，Califonia，http://www.graphpad.com）作图，分析采用F检验，P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度、不同成熟度的沙棘果汁对阴道毛滴虫体外杀灭效果不论是成熟组的还是未成熟组的沙棘果汁，对体外培养的阴道毛滴虫致死时间均随着浓度的升高而降低（见图1）。成熟组内不同浓度的沙棘果汁对阴道毛滴虫的杀灭时间差异具有显著统计学意义（P＜0.0001，F=57.73，R2=0.9665），未成熟组内对应浓度杀灭阴道毛滴虫的时间差异具有显著统计学意义（P＜0.0001，F=163.3，R2=0.9879）；成熟组与未成熟组杀灭阴道毛滴虫的时间长短差异具有显著统计学意义（P＜0.0001，F=776.9，R2=0.9974）。

图1 不同浓度不同成熟度的沙棘果汁体外杀灭阴道毛滴虫的时间

2.2 沙棘果汁对阴道毛滴虫作用部位的研究通过对沙棘果汁作用后的阴道毛滴虫进行扫描电镜和透射电镜观察，电镜图像显示，在阴道毛滴虫虫体表面出现大量的孔洞，而内部细胞器、食物泡及细胞核等的膜则完好无损，这说明沙棘果汁主要是通过破坏虫体表面细胞膜的结构，从而导致细胞内的细胞质外溢引起虫体的死亡（见图2）。

图2 电镜下的沙棘果汁杀灭的阴道毛滴虫

3 讨论

1837 年人们发现并命名了阴道毛滴虫，长期以来由于这种寄生虫是单细胞生物且个体小不易被检获，并且大多数感染者并不出现明显的临床症状，因此导致它对人类的危害被忽视[15]。虽然1959 年甲硝唑便开始在临床上用于治疗滴虫病[16]，但WHO 在1990 年才推荐其为治疗阴道毛滴虫病的首选药物，这种药物具有使用方便、价格低廉、疗效显著等特点。然而在1962 年就开始出现临床治疗阴道毛滴虫失败的报道[17]。除此之外，在临床上使用的药物还包括奥硝唑、替硝唑等硝唑咪唑类药物，但因为3 种药物均为咪唑类药物，对阴道毛滴虫杀灭机制及对人体的毒副作用相似，因此人们一直都在寻找高效低毒的有效药物以防治滴虫病。目前已有多种植物及其产物，如植物的根、茎、花、叶的浸出液或提取物等，及人工合成半合成的化合物用于研究杀灭阴道毛滴虫，包括小檗属、小叶木属、毛竹属、毛竹属、南竹属、白屈菜属、延胡索属和血根属[18]等。

沙棘在我国分布广泛，不仅起到水土保护、防治风沙的作用，并且沙棘植物本身的食用及医用价值大。沙棘叶、沙棘果、沙棘油等被人们用来治疗各种疾病的历史悠久，在妇科方面沙棘油被用以治疗宫颈糜烂，且效果较好，而沙棘籽油栓单用或联合其他药物用以治疗滴虫性阴道炎效果较好[19]，但沙棘油在提炼的过程中因工艺复杂、成本高，被称为植物黄金，并且其成分复杂，分离提纯难，因此在目前工艺下沙棘油在临床上运用受到制约。

在本研究中，采用沙棘果汁对体外培养的阴道毛滴虫进行体外实验，结果表明高浓度的成熟沙棘果汁对阴道毛滴虫具有明显的杀灭作用，与国内相关报道中沙棘果粉对阴道毛滴虫具有杀灭作用的定论一致，然而，在其报道中[12]观察到死亡的阴道毛滴虫细胞碎片，在本研究中并未观察到阴道毛滴虫的碎片，并通过对杀灭的阴道毛滴虫做扫描电镜和透射电镜，图像显示阴道毛滴虫的表面出现了大量的细胞孔洞，而虫体内部的细胞器、食物泡、细胞核等膜结构完整，因此沙棘果汁确实是通过破坏阴道毛滴虫虫体的细胞膜结构来杀灭阴道毛滴虫。通过果粉与果汁2 种不同状态的沙棘果实在体外作用于阴道毛滴虫，证明果粉效果要优于果汁，并且果粉在储备、运输、贮藏、除菌等方面更优于果汁，因此可为未来临床上防治阴道毛滴虫提供理论依据及治疗选择。