新乡地区支气管哮喘患儿发病风险与相关核转录因子等位基因间相关性探讨

郭丽娟

（河南省新乡市第二人民医院 儿科，河南 新乡 457300）

支气管哮喘是儿科常见慢性呼吸系统疾病之一，有报道显示14 岁以下人群发病率约为3%～4%；目前该病已成为影响儿童生长发育重要疾病，给家庭及社会和带来极大负担［1］。目前有关支气管哮喘病因及发病机制仍存在争议，大部分学者认为支气管哮喘发生受多种因素综合影响，除环境因素外遗传因素亦在其中发挥着关键作用［2］。核转录因子STAT3 已被证实可参与到人体正常生理、感染及肿瘤病理生理改变；有报道证实不同免疫系统疾病发生可由相同基因多态性介导并能够相互影响疾病通路调节［3］；而STAT3 基因多态性与系统性红斑狼疮和溃疡性结肠炎易感性有关［4］。基于以上证据，本次研究纳入河南省新乡市第二人民医院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小儿支气管哮喘患儿260 例和体检健康儿童290例，采用SSP-PCR 法检测核转录因子STAT3 基因单核苷酸多态性（SNP），探讨本地区小儿支气管哮喘发病与相关核转录因子等位基因间的关系，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

本次研究纳入河南省新乡市第二人民医院2018 年1 月至2020 年1 月收治的小儿支气管哮喘患儿260 例和体检健康儿童290 例；支气管哮喘患儿中男148 例，女112 例，年龄4～9 岁，平均（6.27±2.40）岁；体检健康儿童中男158 例，女132 例，年龄4～8 岁，平均（6.09±2.27）岁。两组性别和年龄比较，差异无统计学意义（P＞0.05），具有可比性。

1.2 纳入及排除标准

支气管哮喘组：均符合儿童变应性哮喘诊断及分度标准［5］，年龄≤14 岁，同时排除川崎病、炎症性肠病及其他免疫系统疾病；体检健康组：年龄≤14 岁，近4 周无感染或发热，排除近4 周使用激素或免疫抑制剂，既往过敏或其他免疫系统疾病史。研究方案经河南省新乡市第二人民医院伦理委员会批准，且患儿家长知情同意。

1.3 方法

1.3.1 DNA 提取和引物设计 抽取外周静脉血2 mL 加入EDTA 抗凝管，取200 μL 采用DNA 提取试剂盒（Qiagen）完成目标DNA 提取，置入-80℃冰箱待检。引物设计合成由英潍捷基公司完成，根据已知STAT3 基因组序列设计SNP 位点正向引物，包含SNP 位点质控正向引物和通用反向引物。具体引物情况：rs2293152 特异正向引物为AACGCGCCTACTTCTTTCCTGCCC，特异反向引物为TAAGTTCCTCTCCTGGCTGTTCCG；rs957970 特异正向引物为CTTATGACATTCTCCAGGTTCATC；特异反向引物为TCTCGTCACGTTTACAAGTAATGCT。

1.3.2 SSP-PCR 反应和琼脂糖凝胶电泳 采用25 μL 反应体系，包括特异性引物0.5 μL、质控正向引物0.5 μL、通用反向引物1 μL、2×PowerTaq Master Mix 12.5μL、DNA 模板2μL，最后加入ddH2O 补足25 μL。rs2293152 反应条件设置：95℃预变性5 min，95℃变性30 s 共8 个循环，60℃退火45 s，72℃延伸45 s；95℃变性30 s 共25 个循环，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。rs957970 反应条件设置：95℃预变性5 min，95℃变性30 s 共35 个循环，50℃退火45 s，72℃延伸45 s，最后72℃延伸5 min。

1.3.3 琼脂糖凝胶电泳 取5 μL PCR 产物加入琼脂糖凝胶（15 g/L），电泳仪电压设定110 V，电泳35 min，采用耶拿UVP Gelstudio touch 凝胶成像仪显像。

1.3.4 质控PCR 产物测序及验证 每个位点随机抽样选取3 分样本采用质控正向引物和通用反向引物扩增，扩增产物包含SNP 位点，产物送至英潍捷基完成直接测序，将测序SNP 位点基因型结果和SSP-PCR 检测结果对比验证。

1.4 统计学方法

选择SPSS 22.0 软件处理数据，计数资料以百分率（%）表示，比较采用χ2检验；相对危险度评估采用优势比法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 H-W 遗传平衡检验分析

H-W 遗传平衡检验分析显示，对照组STAT3基因两个SNP 位点基因型分布频率比较，差异无统计学意义（P＞0.05），提示纳入研究对象具有群体代表性。

2.2 PCR 产物测序质控结果分析

随机抽取样本采用质控引物扩增后含SNP 位点产物直接测序基因型结果与SSP-PCR 法检判定基因型相同，证实SSP-PCR 法检测基因位点准确。

2.3 两组基因型和等位基因分布差异分析

支气管哮喘组rs2293152 位点CC 基因型比例高于体检健康组，差异有统计学意义（P＜0.05）；支气管哮喘组rs2293152C/G 位点C 等位基因比例高于体检健康组，差异有统计学意义（P＜0.05）；C 等位基因儿童发生支气管哮喘风险为G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33）。两组rs957970 位点基因型和等位基因比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 两组基因型和等位基因分布差异分析 ［n(%)］

3 讨论

支气管哮喘目前已成为全球性疾病，在发达国家和发展中国家发病率均较高，同时发病率、致死致残率和病死率均呈逐年增高趋势；而小儿支气管哮喘患儿往往会对生长发育及身心健康产生不利影响［6］。如何进一步探索明确支气管哮喘病因及发病机制以实现疾病早期预防对于改善儿童生活质量及远期预后越来越受到医学界的关注。

喘息是学龄前儿童呼系统常见症状之一，根据病情进展情况可分为早期一过性喘息、早期持续性喘息及迟发性喘息或哮喘［7］。一般仅存在特应性因素的迟发性喘息患儿可进展形成支气管哮喘；对于此类患儿早期诊断早期干预理论上可降低小儿支气管哮喘发病风险，但目前临床仍没有具有较高准确性和特异性预测指标［4］。支气管哮喘已被证实属于多基因遗传性疾病，直系亲属发病比例可达35%～75%［8］。近年来探索支气管哮喘致病基因等分子遗传学研究不断深入，候选基因定位克隆是目前疾病易感基因主要遗传学分析方法，目前200 个以上支气管哮喘发病候选基因已被筛选，参与到机体炎性反应、免疫识别及细胞胞内信号转到等多种生物学活动，如人类白细胞抗原Ⅱ（HLA II）、肿瘤坏死因子α（TNFα）、Toll样受体及白细胞介素（IL）等，基因型均与支气管哮喘有关［9-10］。

核转录因子STAT3 可在人体内多种组织及细胞中表达，作为一种DNA 结合蛋白，其在无功能状态下被胞外信号激活，磷酸化后在细胞核内与特异DNA 片段结合，进而调控相应基因转录表达，发挥调解细胞增殖分化、肿瘤发生及感染进展等多方面［11-12］。已有研究［13］显示，支气管哮喘模型小鼠呼吸道上皮平滑肌细胞STAT3 基因敲除后，尘螨抗原激发呼吸道反应性显著下降，推测STAT3 可能参与到支气管哮喘病情进展过程中。另有报道［14］提示，支气管哮喘患儿血清STAT3 表达水平可见显著提高。此外SSP-PCR 法检测基因多态性位点与直接测序法检测结果具有较高一致性，检测快速且价格相对低廉［2］，故本研究采用SSP-PCR 法分析STAT3 基因多态性与小儿支气管哮喘间关系。

本次研究采用SSP-PCR 法检测本地区STAT3基因，结果显示本地区STAT3 基因rs2293152 和rs957970 均存在SNP，其中rs2293152 位点基因型分布频率与国外报道存在差异［15］，笔者认为这可能与纳入人群种族和地区差异有关。同时支气管哮喘组rs2293152 位点CC 基因型比例高于体检健康组（P＜0.05）；支气管哮喘组rs2293152C/G 位点C 等位基因比例高于体检健康组（P＜0.05）；C 等位基因儿童发生支气管哮喘风险为G 等位基因1.57 倍（=1.57，95%CI：1.07～2.33），证实表明rs2293152C/G 位点C等位基因可能与小儿支气管哮喘发生有关，属于易感基因，故可针对此类人群可能早期干预。但两组rs957970 位点基因型和等位基因比例比较，差异无统计学意义（P＞0.05），则说明rs957970 位点SNP 与小儿支气管哮喘发生无关。以上结果为明确小儿支气管哮喘致病基因提供更为充足证据。

本次研究亦存在一定不足：①作为小样本单中心回顾性报道，所得结论无法完全排除混杂因素影响；②因临床资料不全无法进一步分析rs2293152 位点多态性与小儿支气管哮喘疾病严重程度相关性，而是否可影响STAT3 基因表达及生理功能仍需后续研究确证。

综上所述，本地区小儿支气管哮喘发病与STAT3 基因rs2293152C/G 位点有关，其中C 等位基因可能为常见易感基因。