SASH1在胃肠道间质瘤中的表达及其临床意义

苟志敏，袁方均

（1.锦州医科大学国药东风总医院 研究生培养基地，湖北 十堰 442000；2.湖北医药学院附属国药东风总医院 普外科，湖北 十堰 442000）

胃肠道间质瘤（GIST）是胃肠道最常见的间质来源肿瘤，占所有胃肠道肿瘤的1%～2%［1］。GIST 被认为起源于Cajal 间质细胞（ICC），胃肠道的起搏细胞。GIST 可发生在整个胃肠道的任何地方，其中约60% 发生于胃，约30% 发生于小肠，约5%发生于十二指肠，约2%发生于结肠及阑尾，约4%发生于直肠，约1%发生于食管［2］。与其他上皮来源肿瘤不同，肿瘤大小以及核分裂象是评价GIST 危险度的两个最为重要的病理特征，但仅靠以上两个病理特征还不能准确评价GIST 的恶性程度［3-4］。

目前普遍的认知是基因突变在恶性肿瘤发生发展中发挥主要作用，但实际上也有其他的一些因素发挥了重要的作用［5-6］，因此，笔者希望能够发现新的生物标记物用于预测GIST 的恶性程度和临床进程。自SASH1（SAM and SH3 domain containing 1）基因被发现以来，随着研究的加深，发现该基因可能具有抑制肿瘤发生发展的功能，一些研究集中于其与多种实体瘤的关联［7］。SASH1 属于SLY 家族，包括SASH1、SLY1（淋巴细胞表达的含SH3 结构域）和SLY2（或HACS1、NASH1）。所有进化保守的SLY 家族成员都包含两个蛋白质-蛋白质相互作用区，一个SH3（Src 同源域3）域和一个SAM（无菌α 基序）域。由于这些结构特征，SASH1 在细胞内信号转导中发挥着重要作用；其中一个作用涉及与肌动蛋白细胞骨架相互作用和刺激细胞-基质粘附［8-10］。既往研究表明，SASH1 与肿瘤细胞侵袭和迁移的一些重要过程紧密相关。ZELLER 等［7］发现，在6 个乳腺癌细胞系中，SASH1 mRNA 的表达显著降低或完全缺失。ZELLER 等还发现，肿瘤大小和预后与SASH1 下调程度相关，此外，在原发性甲状腺肿瘤中也观察到SASH1 表达显著降低［7,11］。并且有研究发现SASH1 表达的降低或缺失与其他恶性肿瘤的侵袭性生长、转移以及低生存率都存在相关性［12-17］。然而，SASH1 在间质细胞来源肿瘤中是否发挥着类似的作用以及SASH1 表达与GIST 患者预后之间的关系尚不清楚。本研究的目的是为了评估SASH1 在GIST 的表达，并阐明SASH1 表达与GIST 风险分类以及临床病理特征之间的关系。

1 材料与方法

1.1 标本来源

收集了2017 年至2021 年间国药东风总医院胃肠外科共74 份患者来源的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）胃肠间质瘤组织样本。临床数据（包括年龄、性别、肿瘤大小、核分裂象）和其他信息均来自每位患者的医疗记录。采用2013 版中国胃肠道间质瘤病理诊断治疗共识推荐的NIH2008年改良版对肿瘤的危险度进行分级。获得样本的患者在手术前均未接受放疗、新辅助化疗或免疫治疗。所有参与本研究的患者均获得书面知情同意书。所有方法和方案均按照国药东风总医院的相关指南和规定执行。这项工作得到了国药东风总医院伦理委员会的批准。

1.2 免疫组织化学染色

脱蜡：将准备好的石蜡组织切片（3µm）置于60℃温箱中约烘烤2 h，然后于二甲苯中脱蜡，通过分级酒精再水合，在3% 过氧化氢中浸泡15 min 以阻断内源性过氧化物酶活性。在10 nmol/L柠檬酸盐缓冲液（pH=6.0）中压力蒸煮4 min，然后将载玻片与10%正常山羊血清在室温下预孵育30 min，以减少非特异性反应。随后，PBS 润洗3 min×3 后滴加鼠抗人SASH1 抗体（Sigma 公司，1∶500），4℃过夜。PBS 润洗3 min×3 后滴加Envision 二抗（GeneTech），37℃孵育30 min，最后用DAB（3,3'-二氨基联苯胺）染色，去离子水终止显色，苏木素复染20 s，盐酸酒精分化5 s；自来水冲洗15 min 返蓝；中性树脂封片。采用已知的免疫染色阳性玻片用作阳性对照。

1.3 结果判定

每张载玻片检查五个视图，在×400 放大率下，每个视图观察100 个细胞。由两名经验丰富的病理科医生根据阳性细胞的分布、强度和百分比对SASH1 表达进行分级，并对每张玻片染色结果取得一致意见。SASH1 的表达通常分为四级：阴性（0%）、弱阳性（≤30%）、中等阳性（≤60%）和强阳性（＞60%）。

1.4 统计学方法

所有数据均使用SPSS 22.0 软件进行处理。计数资料以百分率（%）表示，用χ2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 SASH1 在GIST 中的表达存在差异性

对74 例GIST 的石蜡切片进行免疫组织化学染色发现，SASH1 均表达在细胞核内，且表达量存在明显的差异，其中33 例为高表达，而剩余41 例为低表达。见图1。

图1 肿瘤组织及相应正常组织中SASH1 的表达

2.2 GIST 中SASH1 的表达水平与临床病理因素之间的关系

对SASH1 的表达强弱与GIST 的病理特征以及危险度进行相关分析显示，SASH1 的高表达与较多的核分裂象呈负相关（r=0.404,P=0.033）；SASH1 在极低或低风险GIST 患者中的表达高于中等或高风险GIST 患者（r=0.250,P=0.028）；SASH1的表达与患者的年龄、性别、肿瘤发生部位及肿瘤大小之间均无相关性（P＞0.05）。见表1。

表1 SASH1 表达水平与GIST 的临床病理因素的关系（例）

3 讨论

胃肠间质瘤通常在生物学行为和预后方面都展现出很大的异质性和不可预测性，且大部分GIST 在完全切除后仍有复发和弥漫性生长的可能，并具有远处转移的能力。大约50% 的胃和非胃GIST 在肿瘤完全切除后5 年内复发。近年来，随着医疗水平的进一步提高，通过手术切除和靶向药物（伊马替尼）的联合治疗大大提高了GIST 患者的生存时间，但仍有许多患者死于肿瘤的局部复发以及远处转移，故识别其复发转移的危险因素极为重要。先前的研究已经提供了足够的证据证明SASH1 代表了一种新的候选肿瘤标志物。SASH1 由两个SAM 结构域和一个SH3 结构域组成，它们参与信号适配器蛋白或支架因子，被认为在细胞内信号转导中起关键作用。SH3 结构域与富含脯氨酸的基序结合［18-19］，两个相关蛋白质上的结合位点长度为10 个氨基酸［20］。SAM 结构域可以通过自结合或与其他蛋白质的SAM 结构域相互作用来介导蛋白质-蛋白质相互作用［21-22］。SAM 结构域还可以介导Smaug 蛋白和mRNA 之间的结合，以调节转录［23］。鉴于上述发现，SASH1被认为会影响肿瘤的侵袭和转移，这种推测已在评 估U251 胶质瘤细胞［24］、A549 人肺腺癌细胞［17］、A-375 黑色素瘤细胞［25］和MG-63 骨肉瘤细胞［26］的研究中得到证实。然而，这些研究都没有研究SASH1 在GIST 中表达的相关临床意义。

在这项研究中，笔者使用免疫组化方法检测了GIST 样本以及相应的正常组织中SASH1 蛋白的表达。发现SASH1 在肿瘤中的表达低于相应邻近正常组织和手术切缘的表达，在GIST 中，低SASH1 表达与患者的风险分级具有相关性，且随着肿瘤的恶性程度进一步提高，SASH1 表达显著降低。与前人研究中使用的方法相比，笔者在实验和分析中使用的方法有两个优点：首先，TMA的使用允许对所有样本进行统一评估，从而能够创建用于评估不同组织中染色强度和阳性细胞百分比的可比标准；其次，使用大样本GIST 患者进行分析可以提高相对可信度。但本研究仍有局限性，由于主要采用回顾性观察，因此结果可能缺乏普遍适用性，这需要进一步研究SASH1 的确切功能，如构建质粒，以证实笔者的发现和假设：GIST 中SASH1 表达降低预示着预后不良。

综上所述，笔者认为SASH1 可以被视为一种新的生物标记物和一个有希望的GIST 治疗靶点。