miR-143-3p在甲状腺乳头状癌发展进程中的临床意义

秦小静，马 微，薛 刚，王冬梅，吴靖芳，范会利

0 引 言

甲状腺癌是内分泌系统最常见的恶性肿瘤，近40年来甲状腺乳头状微小癌在全球呈现出“爆发式”增长趋势[1]。甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)在新增的甲状腺癌中约接近90%[2]。MiRNA与PTC的发生发展、转移及其侵袭力相关，并且作为一种生物标记物辅助诊断、监测复发[3]。MicroRNA(miRNA)是长度为19～25个核苷酸的高度保守的单链非编码RNA分子，通过与相应靶信使RNA(mRNA)的3'-非翻译区(3'-UTR)相互作用并发挥重要作用[4]。MiR-143-3p在多种恶性肿瘤低表达，起抑癌基因作用，过表达miR-143-3p通过下调不同靶基因抑制卵巢癌、结直肠癌、胰腺癌、乳腺癌的增殖、迁移和侵袭，有望成为癌症的潜在治疗靶点[5-8]。但截止投稿日期，miR-143-3p在PTC中的作用研究尚未见报道。本研究前期发现三叶因子3(trefoil factor family 3, TFF3)可以通过MAPK信号通路来影响PTC的上皮间质转化进程[9]。本研究旨在探讨PTC中miR-143-3p表达水平、临床意义及过表达对PTC上皮间质转化的影响及其可能机制。

1 资料与方法

1.1 组织标本收集2019年1月至2020年8月52例在河北北方学院附属第一医院耳鼻咽喉-头颈外科手术切除患者的PTC组织及距肿瘤边缘2cm以上的癌旁组织。液氮速冻后保存于-80℃低温冰箱备用。所有患者术前均无放疗化疗及免疫治疗等抗肿瘤治疗史，全部术后病理切片均经2名副高职称以上的病理科医师复核证实。本实验经医院伦理委员会批准(批准号：W2019156)，患者均签署知情同意书。

1.2主要试剂及细胞系胎牛血清、RPMI 1640、DMEM培养基购自美国Gibco公司；miR-143-3p mimics、阴性对照组mimics-NC、miR-143-3p、U6引物购自中国广州锐博生物科技公司；qRT-PCR试剂盒购自中国天根生化科技(北京)有限公司；双荧光素酶报告检测试剂盒购自美国Promega公司; 包含TFF3-3'UTR野生型(WT-TFF3-3'UTR)和突变序列(MUT-TFF3-3'UTR)的双荧光素报告基因质粒由北京合生基因公司设计合成，Matrigel基质胶、Transwell小室购自美国Corning公司；相关抗体购自美国Abcam公司。人甲状腺乳头状癌细胞株TPC-1、BCPAP、 K1及人正常甲状腺细胞Nthy-ori 3-1细胞株购自北纳创联生物技术研究院。

1.3Real-time PCR检测miR-143-3p表达Trizol法提取组织样品和细胞总RNA，超微量分光光度仪测定RNA的吸光度(A)。miR-143-3p的正向引物序列为5'- UGAGAUGAAGCACUGUAGCUC-3'，反向引物序列为5'- GAGCUACAGUGCUUCAUCUCA-3'；内参U6的正向引物序列为5'- UUUGUACUACACAAAAGUACUG-3'，反向引物序列为5'-CAGUACUUUUGUGUAGUACAAA-3'。按照逆转录说明书将RNA逆转录为cDNA，将cDNA稀释后根据Real-time PCR试剂盒说明书进行Real-time PCR实验，反应条件为95℃预变性30 s，40个循环扩增反应(95℃5 s，65℃30 s)。最后，以U6作为内参，miR-143-3p的相对表达用2-△△Ct法计算。计算得到的miRNA-143-3p的相对表达量数值以中位数为截断值，将PTC组织miRNA-143-3p的表达水平分为低表达组和高表达组，并分析其表达高低与临床病理参数的关系。

1.4细胞培养和转染TPC-1、BCPAP、K1和Nthy-ori 3-1细胞分别培养于10%FBS、1%青链霉素的1640或DMEM培养基，放置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养。每2天换液一次，待细胞汇合度至80%～90% 时，PBS洗3遍，加入1 mL胰蛋白酶消化并按1∶2传代，最后取对数生长期的细胞用于实验。

根据LipofectamineTM3000说明书进行操作，在转染前一天将细胞铺板，待细胞长至70%～80%汇合度时，进行细胞转染，按每孔5 μL miR-143-3p mimics进行转染，取转染48 h后的细胞进行后续操作。实验分为3组：空白对照组(TPC-1)、阴性对照组(mimics-NC)和mimics-143-3p组。

1.5细胞增殖实验取对数生长期的3组细胞，铺6孔板，转染48 h后加入1mL 0.25 %胰蛋白酶消化细胞，细胞计数板计数并将1×104个细胞按实验分组分别接种于96孔板，以RPMI1640完全培养基培养并置于ESSEN BIOSCIENCE 公司的IncuCyteZOOM长时间动态细胞成像设备培养，并拍照，待细胞长满后，分析数据并绘制生长曲线。

1.6细胞划痕取对数生长期的3组细胞，铺6孔板，转染细胞48h后加入1mL 0.25 %胰蛋白酶消化细胞，细胞计数板计数，制备成5×105/mL的单细胞悬液，接种于新的6孔板，1640完全培养基补足2 mL。置于细胞培养箱培养至细胞汇合度为90%时，用白色枪头在6孔板内垂直划线，PBS洗3遍，加入无血清培养基置于37 ℃，5%CO2培养箱中，分别于0 h、12 h、24 h在显微镜下拍照，Image J测量细胞迁移率并分析。

1.7Transwell实验取对数生长期的3组细胞，铺6孔板，转染细胞48 h后更换为无血清培养基饥饿12 h，加入1 mL 0.25%胰蛋白酶消化细胞，细胞计数板计数，使细胞密度达到5×105/mL，置于transwell小室的上室，下室加入500 μL含有10% FBS的1640培养基，24 h后，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色，PBS洗涤，置于显微镜下观察、拍照、计数。

1.8双荧光素酶报告基因实验用TargetScan网站预测显示miR-143-3p与TFF3-3'UTR存在结合位点，构建TFF3-3'UTR片段的WT-TFF3与MUT-TFF3荧光素酶报告载体。将含有miR-143-3p结合位点及及其突变位点的TFF3-3'UTR片段共转染至TPC-1细胞，转染24 h后裂解各组细胞，按照双荧光素酶活性检测试剂盒说明书检测荧光酶活性。相对荧光酶活性计算公式如下：

相对荧光酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值

1.9Western blot实验取转染48 h后的细胞并提取细胞总蛋白，BCA法蛋白定量。总蛋白定量为30 μg上样，进行电泳实验，湿转法转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1 h后，一抗4 ℃孵育过夜，次日洗膜后再分别加入二抗( HRP标记羊抗兔和羊抗鼠IgG，工作浓度1∶1000)，室温孵育2 h，洗膜后加入ECL显影液显影。

2 结 果

2.1 miR-143-3p在甲状腺乳头状癌中的表达qRT-PCR结果显示，MiR-143-3p在PTC的表达水平(0.47±0.07)较配对癌旁组织(1.01±0.11)明显降低(P<0.05)；在PTC细胞系TPC-1、BCPAP、K1的表达水平(0.33±0.06、0.51±0.09、0.55±0.06)低于滤泡上皮Nthy-ori 3-1细胞系(1.00±0.08)，差异有统计学意义(P<0.001)。

2.2miR-143-3p的表达与癌组织临床病理参数之间的关系MiR-143-3p的低表达与TFF3呈负相关(rs=-0.636，P=0.01)。MiR-143-3p低表达与患者的年龄、肿瘤大小和临床分期有关(P<0.01)。临床分期为Ⅲ+Ⅳ期患者中miR-143-3p的低表达率更高，肿瘤直径较小者miR-143-3p具有更高的低表达率，见表1。

表 1 miR-143-3p的表达水平与PTC临床病理参数的关系

2.3TPC-1细胞中miR-143-3p转染效果评价qRT-PCR显示：mimics-143-3p组miR-143-3p的表达水平为(6.64±0.87)是空白对照组(1.01±0.16)、阴性对照组(1.16±0.29)的6倍(P<0.001)。

2.4过表达miR-143-3p对细胞增殖活性的影响与空白对照组和阴性对照组相比，mimics-143-3p组细胞融合率明显降低(P<0.01)。转染48h时，mimics-143-3p组的细胞融合率较空白对照组、阴性对照组明显降低(P<0.01)。说明过表达miR-143-3p能抑制细胞增殖活性。见图1，表2。

图 1 miRNA-143-3p干扰TPC-1 细胞后在24、48、72、96 h汇合度

表 2 各组TPC-1细胞转染后的增殖情况

2.5过表达miR-143-3p对细胞的迁移、侵袭能力的影响划痕实验结果显示： mimics-143-3p组细胞的迁移率、侵袭数目较阴性对照组、空白对照组明显降低(P<0.05) ，见图2、图3和表3。

图 2 miRNA-143-3p干扰TPC-1 细胞后0，12，24h细胞迁移能力

图 3 miRNA-143-3p干扰TPC-1 细胞后细胞侵袭能力

表 3 各组TPC-1细胞转染后的迁移情况

2.6miR-143-3p与TFF3的靶向关系验证TargetScan预测显示TFF3的3'UTR含有miR-143-3p的互补序列，采用双荧光素酶报告实验检测发现，miR-143-3p能明显抑制野生型WT-TFF3 3’UTR 载体的荧光强度，而无法影响突变型MT-TFF3 3’UTR载体的荧光强度(P<0.001)。Western blot实验结果显示，过表达miR-143-3p后，mimics-143-3p组TFF3蛋白表达(0.60±0.06)较空白对照组(0.94±0.08)、阴性对照组(0.93±0.10)明显降低(P<0.01)。 见图4。

图 4 细胞中TFF3蛋白含量

2.7Western blot检测转染后各组细胞中EMT相关蛋白的表达mimics-143-3p组细胞上皮相关标记物蛋白E-cadherin表达较空白对照组、阴性对照组增强；同时，间充质表型相关标记物蛋白N-cadherin和波形蛋白(vimentin)表达降低(P<0.05)。见图5。

1:空白对照组; 2:阴性对照组; 3:mimics-143-3p组

3 讨 论

近年来，随着诊疗技术敏感性和特异性的提高，PTC的发病率逐年升高。通过早发现、早手术，90%的PTC患者可长期生存。然而，对于PTC的手术切除范围、淋巴结清扫等方案尚无明确标准，临床上存在过度治疗现象[10]。MiRNAs是一类内源性非编码小RNA分子，通常靶向一个或者多个mRNA的3'-UTRs，在翻译水平抑制或降解目的mRNA，负向调节靶基因的表达，广泛调控细胞的生长、侵袭、分化及凋亡等重要生物学过程[11-13]。目前，许多研究已经确定了miRNA作为潜在的抗癌治疗分子和预后评价指标。如卵巢癌miR-143-3p可作为潜在治疗靶点、胰腺癌miR-143-3p可通过靶向KRAS抑制肿瘤发生、结直肠癌miR-143-3p低表达与肿瘤直径和淋巴结转移有关，患者血清miR-143-3p可以作为潜在非侵入性生物标志物[5-7]。在食管鳞状细胞癌中，miR-143-3p通过靶向QKI-5作为肿瘤抑制因子，抑制食管鳞状细胞癌的进程[12]。Sun等的研究发现miR-143-3p在骨肉瘤中存在表达异常，抑制骨肉瘤细胞的增殖和转移，促进细胞凋亡[13]。

为明确miR-143-3p在PTC中临床意义及作用机制，本研究通过qRT-PCR对52对PTC患者癌与癌旁组织中miR-143-3p的表达水平进行了检测，发现miR-143-3p在PTC组织中呈低表达，提示miR-143-3p与PTC的发生有关，可能在PTC中起抑癌基因的作用。进一步分析miR-143-3p与PTC患者临床病例特征的关系发现miR-143-3p低表达与PTC患者的年龄、临床分期和肿瘤大小密切相关，Ⅲ+Ⅳ期亚组中miR-143-3p的低表达率明显高于Ⅰ+Ⅱ期，提示miR-143-3p的低表达与PTC的发展有关。冯等的研究表明miR-143-3p通过靶向EZH2并下调其表达水平进而抑制结肠癌RKO细胞的增殖、迁移与侵袭[14]；另一项研究也表明miR-143-3p通过靶向TAK1并抑制肺癌细胞的增殖和侵袭[15]。鼻鳞癌组织和细胞系同样显示miR-143-3p低表达，其上调可显著诱导细胞凋亡和G1期阻滞，减弱细胞增殖和迁移[16]。为了进一步研究miR-143-3p对甲状腺乳头状癌TPC-1细胞增殖、侵袭和迁移等恶性生物学行为的影响及机制，本实验通过体外实验在甲状腺乳头状癌TPC-1细胞中转染miR-143-3p mimics，使miR-143-3p的表达上调，通过生长曲线、Transwell和划痕实验对转染miR-143-3p前后的TPC-1细胞检测。结果表明过表达miR-143-3p后，细胞增殖活性明显降低，侵袭及迁移能力明显下降，进一步证实了miR-143-3p在PTC中能够抑制TPC-1细胞的恶性生物学行为，起着抑癌基因的作用。

本研究发现miR-143-3p与TFF3的3'UTR存在种子序列互补的结合位点，因此预测TFF3可能是miR-143-3p的靶基因。为了验证其靶向关系，我们通过western blot检测发现，转染了miR-143-3p mimics的TPC-1细胞中，TFF3的表达水平明显降低，进一步我们通过双荧光素酶报告实验表明，miR-143-3p明显抑制TPC-1细胞中TFF3-WT-3'UTR的荧光素酶活性，而对TFF3-MuT-3'UTR的荧光素酶活性无明显抑制作用，证明了miR-143-3p能够特异性的靶向结合TFF3的3'UTR 区。上皮间质转化(EMT)是癌细胞从原发部位到远处组织或淋巴结转移的重要过程，上皮细胞逐渐获得间质特征并增强迁移和侵袭性[17]。研究表明SRF通过上调miR-143-3p的表达参与了高糖刺激下引起的人腹膜间皮细胞的转分化过程[18]。TPC-1细胞过表达miR-143-3p后，上皮间质物N-cadherin、Vimentin表达明显降低，而E-cadherin蛋白表达明显增强。这与Transwell、划痕实验结果相似。表明miR-143-3p可以抑制TPC-1细胞的侵袭、迁移能力，抑制PTC的上皮间质转化进程。TFF3作为癌基因参与多种恶性肿瘤的进展，促进甲状腺乳头状癌TPC-1细胞的增殖、侵袭及迁移[9,19]。可见，miR-143-3p通过靶向TFF3基因发挥抑制TPC-1细胞增殖、侵袭和迁移。进一步为PTC诊疗提供新的靶点。

综上所述，miR-143-3p在甲状腺癌组织和细胞中的表达降低，可以通过靶向TFF3抑制TPC-1细胞的恶性生物学行为，为甲状腺癌诊断和靶向治疗提供了新的靶点。本研究具有一定的局限性，仅对本地区的PTC患者做了临床病理分析，具有地域的局限性；同时本研究仅做了体外细胞实验，探索miR-143-3p影响甲状腺乳头状癌的上皮间质转化进程的具体作用机制及其通路，尚需要通过进一步的深入研究。