二氢黄腐酚通过调控HK2表达对人卵巢癌顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP的耐药性影响

王 慧，王 静，闫冬娟，茹晓楠，马春星，王思思，陈江平，康燕华

0 引 言

卵巢癌是常见的女性生殖系统恶性肿瘤，在妇科恶性肿瘤中死亡率位居首位，顺铂(DDP)化疗是卵巢癌重要治疗途径之一，但由于很多患者出现化疗耐药现象，这给卵巢癌的治疗带来了困难[1]。黄腐酚属于异戊二烯基类物质，首次发现于啤酒花，对糖尿病、癌症等有防治作用[2]。黄腐酚衍生物种类繁多，具有不同的生物学功能，二氢黄腐酚 (dihydroxanthohumol, DXN)是黄腐酚衍生物之一，对肝癌、结肠癌生长有抑制作用[3]。目前对DXN在卵巢癌DDP耐药中的作用尚不清楚。有氧糖酵解是肿瘤细胞增殖等生物学功能的基础，己糖激酶2(hexokinase 2,HK2)是有氧糖酵解中的关键酶，其在肿瘤中过度表达，而抑制HK2可抑制肿瘤生长，改善肿瘤耐药[4]。本研究以人卵巢癌DDP耐药细胞株SKOV3/DDP作为研究对象，探讨DXN调控HK2影响卵巢癌DDP耐药的机制，为临床上改善卵巢癌耐药提供参考思路。

1 材料与方法

1.1 实验材料SKOV3/DDP细胞购自通派(上海)生物科技有限公司；葡萄糖检测试剂盒购自广州伟伯科技有限公司产品；乳酸检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司产品；siRNA control、HK2 siRNA、阴性对照载体(pcDNA)、HK2过表达载体(pcDNA-HK2)、空载质粒(Vector)由云舟生物科技(广州)有限公司构建；HK2抗体购自美国Abcam公司产品；顺铂购自北京索莱宝科技有限公司；DXN购自美国Hopsteiner公司；Lipofectamine© 2000购自美国Invitrogen公司。

1.2方法

1.2.1 分组处理SKOV3/DDP细胞以含胎牛血清(10%)的RPMI1640细胞培养液培养，SKOV3/DDP细胞培养至对数期后，分成对照组、DXN组、DDP组、DXN+DDP、DXN+DDP+ Vector、DXN+DDP+HK2、si-NC、si-HK2组。对照组为常规方法培养的细胞；DXN组、DDP组细胞分别在实验开始时给予4 μmol/L DXN、4 mg/L DDP处理；DXN+DDP组细胞在实验开始时给予4 μmol/L DXN联合4 mg/L DDP处理；DXN+DDP+Vector、DXN+DDP+HK2组细胞在用4 μmol/L DXN联合4 mg/L DDP处理前24 h，分别在细胞中转染空载质粒、HK2过表达载体；si-NC、si-HK2组分别为转染siRNA control、HK2 siRNA的细胞。各组细胞培养48 h后，进行后续实验指标检测。细胞转染按照转染试剂Lipofectamine© 2000说明书操作。

1.2.2MTT实验检测增殖SKOV3/DDP细胞种植在96孔细胞培养板内(细胞接种密度为5×103个/mL)，分别在细胞中添加0、4、8、16、32、64、128、256 μmol/L的DXN(培养24 h、48 h、72 h)，在细胞中添加0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP(培养48h)，按照1.2.1中分组方法(48 h)处理，在每个孔内添加10 μL的MTT，在37 ℃继续培养4 h。弃掉上清溶液，加入150 μL的二甲基亚砜，10 min后，上酶标仪测定光密度值(A值)，测定波长为450 nm。常规方法计算细胞存活率。公式如下：

细胞存活率=(实验组A值÷对照组A值)×100%

1.2.3Western blot检测HK2蛋白表达SKOV3/DDP细胞按照1.2.1中方法处理培养48 h后，收集细胞，用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline，PBS)洗涤2次，添加含有蛋白酶抑制剂的RIPA溶液，放在冰上裂解20 min，12 000×g离心10 min(离心半径13.5 cm)，吸取上清，经过BCA方法测定浓度以后，在蛋白中添加Loading Buffer混合，在100 ℃煮沸5 min。配制10%的分离胶、5%的浓缩胶，每个样品孔中添加40 μg蛋白，以90 V电压在浓缩胶中电泳，观察蓝色染料即将要进入分离胶时，将电压调整到120 V，继续在分离胶中电泳，肉眼观察蓝色染料进入凝胶的下端边缘时，停止电泳，关闭电源。取出凝胶，将分离胶浸泡在转移缓冲液中，同时裁剪聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜，在甲醇中平衡后，放在转移缓冲液中备用，按照“三明治”顺序转膜，设置4 ℃，250 mA恒流转膜2 h。PVDF膜置于5%脱脂奶粉中，在室温中结合1.5 h。然后将PVDF膜放在1∶1000稀释后的一抗内，在4 ℃反应过夜。PVDF膜置于1∶4000稀释后的二抗内，在室温结合1.5 h。ECL发光。Image J扫描灰度值。GAPDH作为参照，分析目的蛋白表达量变化。

1.2.4葡萄糖、乳酸测定SKOV3/DDP细胞按照1.2.1中方法处理培养48 h后，吸取上清溶液，用葡萄糖检测试剂盒、乳酸检测试剂盒测定葡萄糖摄取、乳酸产量，步骤完全根据试剂盒说明书操作，结果以相对量表示。

1.2.5MTT法检测DXN对SKOV3/DDP细胞耐药逆转作用SKOV3/DDP细胞种植在96孔细胞培养板内(细胞接种密度为5×103个/mL)，分为以下三组：DXN(0 μmol/L)分别和0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理细胞、DXN(4 μmol/L)+Vector分别和0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理细胞、DXN(4 μmol/L)+HK2分别和0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理细胞。各组培养48小时后在每个孔内添加10 μL的MTT，在37 ℃继续培养4 h。弃掉上清溶液，加入150 μL的二甲基亚砜，10 min后，上酶标仪测定光密度值(A值)，测定波长为450 nm。计算抑制率、半抑制浓度、耐药逆转倍数。

2 结 果

2.1 DXN逆转SKOV3/DDP细胞耐药与0 μmol/LSKOV3/DDP细胞存活率比较，32、64、128、256 μmol/LDXN处理24 h明显降低(P<0.05)，8、16、32、64、128、256 μmol/LDXN处理48 h及72 h明显降低(P<0.05)。24 h、48 h、72 h的IC50分别为90.39、36.84、22.46 μmol/L。DXN可抑制SKOV3/DDP细胞增殖。选择在48 h时对SKOV3/DDP细胞抑制率小于10%的4 μmol/L的DXN联合0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP处理SKOV3/DDP细胞，与0 μmol/LSKOV3/DDP细胞存活率比较，4、8、16、32、64 mg/L的DDP处理降低(P<0.05)，2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP联合4 μmol/L的DXN处理降低(P<0.05)。DDP单独处理的IC50为16.17 mg/L，联合4 μmol/L的DXN处理的IC50为9.72 mg/L，计算逆转倍数为1.66。见表1、表2。

表 1 DXN处理后SKOV3/DDP细胞存活率

表 2 DXN和DDP处理后SKOV3/DDP细胞存活率

2.2DXN增强DDP对SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达和糖酵解的抑制作用与对照组比较，DDP组、DXN+DDP组SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量降低(P<0.05)。与DDP组比较，DXN+DDP组SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量降低(P<0.05)。表明DXN增强DDP对SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达和糖酵解的抑制作用。见图1，表3。

1：对照组；2：DXN组；3：DXN+DDP组；4：DXN+DDP+HK2组

表 3 DXN和DDP处理后SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达量和葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量

2.3抑制HK2降低SKOV3/DDP细胞糖酵解水平与si-NC组比较，si-HK2组SKOV3/DDP细胞HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量均降低(P<0.05)。见图2，表4。

1：si-NC组；2：si-HK2组

表 4 HK2 siRNA转染后SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达量和葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量

2.4抑制HK2逆转SKOV3/DDP细胞耐药与DDP比较，si-NC组和4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理后SKOV3/DDP细胞存活率明显降低(P<0.05)，si-HK2组和2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理后SKOV3/DDP细胞存活率明显降低(P<0.05)。si-NC组、si-HK2组细胞与0、1、2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP处理后，IC50分别为17.92、11.17 mg/L，逆转倍数为1.60。见表5。

表 5 HK2 siRNA对SKOV3/DDP细胞耐药的影响

2.5HK2逆转DXN对SKOV3/DDP细胞糖酵解影响与对照组比较，DXN+DDP+Vector组SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量降低(P<0.05)；与DXN+DDP+Vector组比较，DXN+DDP+HK2组SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达量、葡萄糖相对摄取量、乳酸相对生成量升高(P<0.05)。见图3，表6。

1：对照组；2：DXN+DDP+Vector组；3：DXN+DDP+HK2组

表 6 过表达HK2和DDP处理后SKOV3/DDP细胞中HK2的蛋白表达量和葡萄糖相对摄取量、乳酸的相对生成量

2.6HK2减弱DXN对SKOV3/DDP细胞耐药逆转作用与0 mg/L比较，DXN(0 μmol/L)和4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理后SKOV3/DDP细胞存活率明显降低(P<0.05)，DXN(4 μmol/L)+Vector和2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理后SKOV3/DDP细胞存活率明显降低(P<0.05)，DXN(4 μmol/L)+HK2和2、4、8、16、32、64 mg/L的DDP共同处理后SKOV3/DDP细胞存活率明显降低(P<0.05)。计算DXN(0 μmol/L)、DXN(4 μmol/L)+Vector、DXN(4 μmol/L)+HK2细胞IC50分别为16.59、9.66、13.10 mg/L，DXN对SKOV3/DDP细胞DDP耐药的逆转倍数为1.72，过表达HK2和DXN联合处理对SKOV3/DDP细胞DDP耐药的逆转倍数为1.27。HK2减弱DXN对SKOV3/DDP细胞耐药逆转作用。见表7。

表 7 过表达HK2和DDP处理后SKOV3/DDP细胞存活率

3 讨 论

卵巢癌是常见妇科恶性肿瘤，卵巢癌早期由于缺乏典型的临床症状，70%的卵巢癌患者在确诊时肿瘤已经远远超出了盆腔，DDP、紫杉醇等化疗药物为肿瘤患者带来了很多生机，但卵巢癌患者5年的生存率并没有明显改善，其中关键原因之一是化疗药物耐药，卵巢癌化疗药物耐药是影响患者预后的重要原因[5-6]。啤酒花可为啤酒提供独特的香气，增加啤酒的泡持性及稳定性，其是啤酒酿造的重要原料，啤酒花含有多酚、树脂、黄酮、酒花油等多种成分，具有镇静、抗菌等功效，对麻风、结核和神经衰弱等疾病有治疗作用[7-8]。黄腐酚是啤酒花中的重要黄酮类物质，其主要是由酒花蛇麻腺分泌产生的，有预防癌症的作用[9-10]。DXN是黄腐酚衍生物之一，可抑制肝癌、结肠癌细胞增殖[3]。本研究发现，DXN处理后的SKOV3/DDP细胞增殖能力下降，对SKOV3/DDP细胞无毒性的4 μmol/L的DXN可逆转SKOV3/DDP细胞耐药，逆转倍数为1.66，说明DXN可逆转卵巢癌DDP耐药，DXN可能是未来改善卵巢癌耐药的药物之一，这与之前的研究报道一致，均提示DXN具有抗肿瘤作用。

能量代谢是生命机体活动的基础特征，细胞的增殖、分裂、运动等活动均需要能量作为基础，正常细胞在缺氧条件下才会通过糖酵解方式供能，但肿瘤细胞即使在氧气充足条件下也以糖酵解方式供能，这种被称为“有氧糖酵解”[11-14]。肿瘤细胞“有氧糖酵解”过程中会产生大量的代谢产物，这些代谢产物还可以被细胞利用，为细胞增殖提供原料[15]。“有氧糖酵解”表现为葡萄糖摄取率增加，乳酸产量增加[16]。HK是糖酵解中的首个限速酶，其能够将葡萄糖催化产生葡萄-6磷酸，而葡萄-6磷酸又可以经过糖酵解生成ATP[17-18]。HK有多种亚型，其中HK2是与肿瘤密切相关的蛋白酶之一，HK2可以促进糖酵解顺利进行，促进肿瘤细胞产生能量，为肿瘤细胞的增殖提供条件[19-20]。HK2在卵巢癌中表达上调，并且下调HK2可抑制卵巢癌细胞增殖[21-23]。有研究发现，HK2与肿瘤耐药有关，敲低HK2可改善乳腺癌细胞5氟脲嘧啶耐药，HK2在卵巢癌DDP耐药中发挥促进作用[4,24]。

本研究选择对细胞无毒性的4μmol/L的DXN联合DDP处理SKOV3/DDP细胞，结果发现，DXN对SKOV3/DDP细胞中HK2蛋白表达、葡萄糖摄取量、乳酸生成量影响不大，但可进一步增加DDP对HK2蛋白表达、葡萄糖摄取量、乳酸生成量的抑制作用，这说明DXN可能通过调控HK2影响糖酵解改善SKOV3/DDP细胞耐药。我们进一步研究其机制发现，敲低HK2逆转SKOV3/DDP细胞耐药，降低葡萄糖摄取量、乳酸生成量，并且过表达HK2可逆转DXN对SKOV3/DDP细胞耐药逆转和糖酵解抑制作用，提示DXN通过下调HK2表达抑制糖酵解进而逆转SKOV3/DDP细胞耐药。

总之，DXN可逆转SKOV3/DDP细胞耐药，作用机制与下调HK2表达抑制糖酵解有关，这为改善卵巢癌DDP耐药提供了参考方向，为研究DXN在卵巢癌耐药中的作用机制奠定了基础。目前只分析了DXN在SKOV3/DDP细胞株中的作用，在后续研究中会在多株细胞中验证，并且会继续分析DXN其它的可能作用机制。