BCP 区和前C 区突变检测在慢加急性肝衰竭中的临床价值

王倩倩 胡耀仁 高国生,3

1.宁波大学医学院附属医院检验科，浙江宁波 315020；2.中国科学院大学宁波华美医院肝病科，浙江宁波 315010；3.浙江省消化系统肿瘤诊治及研究重点实验室，浙江宁波 315010

慢加急性肝衰竭（acute–on–chronic liver failure，ACLF）是指在慢性肝脏疾病基础上经急性诱因刺激导致的大量肝细胞坏死的肝衰竭综合征，临床表现为急性黄疸加深、凝血功能重度障碍等。ACLF 的诱因众多，主要包括嗜肝病毒感染、药物和肝毒性物质（如酒精、化学制剂等）摄入等；我国为乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染的高流行区域，因此HBV 相关ACLF 占比高达90%以上。慢性HBV 感染相关疾病重症化的发病机制复杂，与免疫损伤、内毒素血症、微循环障碍等均有关联，系病毒和宿主两方面共同作用的结果，其中HBV 基因突变导致的病毒生物学特性改变及免疫耐受失衡是重要的影响因素。本文基于基因芯片技术对慢性乙型肝炎（chronic hepititis B，CHB）和HBV 相关ACLF 患者基本核心启动子区（basic core promoter，BCP）A1762T/G1764A、前C 区G1896A 突变情况进行检测，以期为阐明HBV 相关ACLF 发病机制提供循证医学依据，并为临床诊治提供新思路。

1 资料与方法

1.1 一般资料

纳入2010 年9 月至2020 年10 月在中国科学院大学宁波华美医院肝病中心就诊的403 例慢性HBV感染患者，其中男349 例，女54 例，年龄36.00（30.00～42.00）岁。根据是否发生ACLF 将其分为CHB 组（369 例）和ACLF 组（34 例）；ACLF 组患者病情好转出院或3 个月内病情稳定者归为缓解组，病情恶化、放弃治疗自动出院、死亡者归为恶化组。纳入标准：①慢性HBV 感染诊断符合《慢性乙型肝炎防治指南（2019 年版）》，临床表现为乏力、畏食、恶心、腹胀、肝区疼痛等；ACLF 诊断符合《肝衰竭诊疗指南（2018 年版）》，临床表现为迅速加深的黄疸、严重凝血功能障碍和程度不等的肝衰竭。排除标准：①合并其他肝炎病毒感染；②合并恶性肿瘤；③合并酒精性肝病、药物性肝病、自身免疫性肝病；④妊娠期女性；⑤关键实验室数据缺失。本研究经中国科学院大学宁波华美医院医学伦理委员会批准同意（批件号：PJ–NBEY–KY–2017–070–01），所有患者均签署书面告知同意书。

1.2 检测方法

所有患者均于入院时检测肝功能、乙肝三系定量、HBV–DNA 和A1762T/G1764A、G1896A 突变，261 例患者检测了凝血酶原时间（prothrombin time，PT）。乙肝三系定量检测采用美国 Abbott 公司ARCHITECT i2000SR化学发光免疫分析仪及配套试剂盒；HBV–DNA 检测采用美国Applied Biosystems公司ABI 7500型荧光定量PCR仪和中山大学达安基因股份有限公司提供的试剂盒；A1762T/G1764A、G1896A 突变检测采用基因芯片法，相关技术由宁波瑞芯生物科技有限公司提供，操作步骤见课题组前期文献。

1.3 统计学方法

采用SPSS 16.0 软件对实验数据进行统计分析。计量资料经Shapiro–Wilk 检验均为非正态分布，采用中位数（四分位数间距）即（Q，Q）表示，两组间比较采用Mann–Whitney检验；计数资料用例数（百分率）[（%）]表示，比较采用χ检验；采用多因素Logistic 回归分析筛选发生ACLF的独立影响因素，并构建联合预测模型。同时绘制受试者操作特征曲线（receiver operating characteristic curve，ROC 曲线），以曲线下面积（area under curve，AUC）评价模型的诊断价值。<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CHB 组和ACLF 组患者的临床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突变情况

ACLF 组患者的年龄、总胆红素（total bilirubin，TBiL）、谷草转氨酶（aspartate transaminase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、凝血酶原时间（prothrombin time，PT）均显著高于 CHB 组（<0.05），乙型肝炎e 抗原（hepatitis B e antigen，HBeAg）阳性率、白蛋白（albumin，ALB）均显著低于CHB 组（<0.05）。两组患者A1762T/G1764A突变率比较差异无统计学意义（>0.05），ACLF 组患者G1896A 突变率显著高于CHB 患者（<0.05），见表1。

2.2 影响ACLF 发生的多因素Logistic 回归分析

对表1 中存在差异的指标进行多因素Logistic 回归分析，结果显示年龄、TBiL、ALB、G1896A 突变均是发生ACLF 的独立影响因素（<0.05），见表2。基于上述4 项指标建立联合预测模型，其诊断ACLF的AUC 为0.950（<0.001），敏感度和特异性分别为88.24%和93.22%，见图1。

图1 联合预测模型诊断ACLF 的ROC 曲线

表1 CHB 组和ACLF 组患者的临床特征及A1762T/G1764A、G1896A 突变情况比较

表2 影响ACLF 发生的多因素Logistic 回归分析

2.3 缓解组和恶化组患者的A1762T/G1764A、G1896A突变率比较

缓解组和恶化组患者的A1762T/G1764A、G1896A突变率比较差异均无统计学意义（>0.05），见表3。

表3 缓解组和恶化组患者的A1762T/G1764A、G1896A 突变率比较[n（%）]

3 讨论

患者感染HBV 后的临床结局受病毒、肝细胞及宿主免疫反应等多方面影响。由于HBV 的复制要经过前基因组RNA 的反转录过程，而反转录酶缺乏稳定的校对功能，在环境压力及药物诱导等作用下，发生突变的频率较高。HBV 变异可打破机体内已经建立的固有免疫平衡，通过改变病毒的生物学特性诱导肝细胞炎症加重，促使严重肝损害的发生。针对乙型肝炎重症化机制的探讨一直是临床关注的焦点，目前针对HBV 变异与ACLF 相关性的研究较少，且结论存在争议。

本研究对369 例CHB 患者和34 例ACLF 患者的A1762T/G1764A、G1896A 突变进行检测，发现ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突变率分别为61.76%、50.00%，而CHB 患者A1762T/G1764A和G1896A 的突变率分别为59.08%、31.17%，其中G1896A 突变在ACLF 患者中显著增高。有研究者认为ACLF 患者的A1762T/G1764A 和G1896A 突变率均显著高于CHB 患者，特别是马晓艳等发现A1762T/G1764A 突变率高达90%。闫涛等则认为ACLF 患者的A1762T/G1764A 突变率约为73.50%，且不具备ACLF 特异性。赵振刚也认为A1762T/G1764A 突变在ACLF 和CHB 患者之间无差异。Malik等对567 例印度籍HBV 感染者的病毒变异情况进行了研究，发现A1762T/G1764A 突变在CHB和暴发性肝炎中的发生率分别为33.5%和37.6%，两组间未见显著差异，认为A1762T/G1764A 突变与肝脏炎症加剧无关。由此可见不同文献对HBV 基因突变率的报道差异较大，分析原因可能与纳入研究对象的选择、地域、种族，甚至检测手段等的不同均有关联。

本研究结果显示，年龄、TBiL、ALB、G1896A突变均是发生ACLF 的独立影响因素，G1896A 突变者发生ACLF 的风险是无突变者的3.6 倍。徐航娣通过多因素分析发现T216C、G1896A、C1913A/G 和A2159G/C 均是ACLF 发病的独立危险因素，这与本研究结论吻合，由此可见G1896A 突变与慢性乙肝重症化密切相关。由于HBeAg 与乙型肝炎核心抗原（hepatitis B core antigen，HBcAg）针对T 细胞表现出类似的免疫原性，故前者在某种程度上抑制细胞毒性T 淋巴细胞对肝细胞表面的HBcAg 免疫攻击，进而诱导机体免疫耐受的产生。G1896A 突变的出现导致第28 位密码由色氨酸TGG 突变成终止密码TAG，减少或终止HBeAg 的合成，这将引起机体免疫系统对受感染的肝细胞发动高强度的杀伤作用，促使肝细胞大量急性坏死而发生肝衰竭。另外，HBV 基因突变还可引起调节性T 淋巴细胞、辅助性T 淋巴细胞17 表达上调，进一步加剧机体免疫状态的失衡。既往关于A1762T/G1764A、G1896A 突变与ACLF 预后的关系也多有探讨，余彩霞等认为A1762T/G1764A、G1896A 突变与预后不良有关；但肖蕾发现A1762T/G1764A、G1896A 突变可能与转归无关，这与本研究结论一致。

综上，HBV 相关ACLF 患者的前C 区G1896A突变率显著增高，G1896A 突变是ACLF 发病的独立危险因素，而BCP 区A1762T/G1764A 突变与ACLF的关系可能并不紧密。本研究也存在一定的局限性，某些关键性指标如PT 由于检测不完整，未纳入最终的分析可能影响最终结果，且本研究样本量较小，确切结论仍需大样本、多中心、设计更合理的研究予以验证。