副猪嗜血杆菌血清7型菌株毒力及耐药性分析

王治方，徐引弟,朱文豪，张青娴，焦文强，李海利，王克领

(河南省农业科学院畜牧兽医研究所，郑州 450002)

副猪嗜血杆菌(Haemophilusparasuis,Hps)是一种革兰氏阴性、形态多变、NAD依赖型细小杆菌，可长期寄生于猪的上呼吸道中，是当前规模化猪场主要的细菌性病原之一。当机体抵抗力降低时，可感染不同年龄、品种的猪，临床上断奶前后和保育仔猪发病率、死亡率较高，主要表现为多发性纤维素性浆膜炎、关节炎等病症[1]。该病呈世界范围内流行，每年给养猪行业带来巨大的经济损失。

Hps致病机制非常复杂，临床可单独感染发病，更多是作为继发病原与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪圆环病毒、猪流感病毒等病原引发混合感染，加重病情和危害程度。其临床血清型较多，已鉴定出15个血清型，还有20%左右的临床菌株无法分型。Hps不同血清型的毒力及致病性存在较大差异，甚至同一血清型不同菌株的致病力也有一定差异，发病情况也不尽相同[2-3]。菌株毒力与其携带的毒力基因有密切关系。有资料表明，Hps血清1、5、10、13、14型为高毒力,2、4、15型为中等毒力,其他血清型划分为无毒力[4-6]。但最近几年，本实验室在临床典型病例中不断分离出Hps血清7型菌株，证明Hps血清7型在临床感染率越来越高。为了解河南地区Hps血清7型流行菌株的相似性、毒力和耐药性，本研究以Hps血清7型参考菌株为对照，对6株Hps血清7型临床菌株进行16S rRNA基因扩增、测序分析、毒力基因检测、致病性试验和药敏试验研究，以期为Hps血清7型的流行病学研究及临床防控提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 6株Hps血清7型受试菌株由本实验室临床分离鉴定并保存，菌株信息见表1。Hps血清7型参考菌株，编号0007，由华中农业大学动物医学院农业微生物国家重点实验室惠赠。

表1 菌株信息

1.1.2 主要试剂及仪器 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)、胰蛋白胨大豆肉汤(碧迪医疗器械(上海)有限公司)；犊牛血清、50×TAE 浓缩液琼脂糖和DNA提取试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)；烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(辅酶Ⅰ，NAD)(Roche公司)；PremixTaqTM(TaKaRaTaqTMVersion 2.0 Plus Dye)、DL2000 DNA Marker、DNA提取试剂盒(宝生物工程(大连)有限公司)；药敏片(杭州滨河微生物试剂有限公司)。

Thermo 5020 PCR扩增仪、Thermo 1300SERIES A2生物安全柜(赛默飞世尔科技(中国)有限公司)；电泳仪(DYY-6型) (北京市六一仪器厂)；凝胶成像系统(沙船(天津)生物科技发展有限公司)；5418台式高速离心机(Eppendorf公司)。

1.1.3 试验动物 7周龄体重约250 g健康雄性豚鼠40只，购自郑州大学实验动物中心。

1.2 方法

1.2.1 菌株DNA提取 将参考菌株和6株临床菌株分别接种于TSA平板(含5%的犊牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培养箱培养36 h，挑取典型菌落，按照DNA提取试剂盒说明书分别提取菌株的DNA，分装备用。

1.2.2 菌株鉴定及序列分析 参照文献[7-10]设计合成Hps 16S rRNA基因特异性引物和Hps血清7型引物，引物信息见表2。引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。以提取的菌株DNA为模板，对受试菌株进行PCR扩增鉴定。PCR反应体系25 μL：2×PremixTaqTM13 μL，模板DNA 2 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min；95 ℃变性1 min，退火(退火温度见表2)1 min，72 ℃延伸30 s，共40个循环；72 ℃延伸10 min。反应完成后，取10 μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统观察结果、拍照。

表2 Hps 16S rRNA及血清7型引物信息

将菌株16S rRNA基因PCR扩增产物送北京擎科生物科技有限公司测序,利用DNAStar、Mega 6.0软件将菌株16S rRNA基因测序结果与GenBank数据库中获取的相近的参考菌株基因序列进行比对分析，构建系统进化树。参考菌株信息见表3。

表3 参考菌株信息

续表

1.2.3 毒力基因检测 参照文献[11-13]合成副猪嗜血杆菌相关毒力基因的引物，引物信息见表4。以提取的菌株DNA为模板，进行菌株毒力基因PCR扩增检测，鉴定菌株携带毒力基因情况。PCR反应体系25 μL：2×PremixTaq13 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各1 μL，模板DNA 2 μL，ddH2O 8 μL。PCR反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性1 min，退火(退火温度见表4)1 min，72 ℃延伸30 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。反应完成后，取10 μL PCR扩增产物进行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，紫外成像系统观察结果、拍照。

表4 毒力基因引物信息

续表

1.2.4 致病性试验 将40只试验豚鼠随机分为试验组和对照组，试验组7组，对照组1组，每组5只。挑选纯化好的单个菌落接种于TSB(含5%的新生牛血清和0.001% NAD)液体培养基中，37 ℃振荡培养24 h，计数备用。调整菌液浓度至2.0×109CFU/mL，试验组豚鼠腹腔注射调整好的菌液0.5 mL/只；对照组豚鼠腹腔注射生理盐水0.5 mL/只。接种后仔细观察记录每组发病情况，连续观察10 d，对发病豚鼠进行细菌分离鉴定。

1.2.5 药敏试验 采用纸片扩散法对受试菌株和参考菌株进行药敏试验。将参考菌株和6株临床菌株分别接种于TSA平板(含5%的犊牛血清，0.001% NAD)上，于37 ℃、5% CO2培养箱培养24 h，分别挑取各菌株的典型菌落，用灭菌PBS液制成浓度为0.5麦氏单位的菌悬液，用灭菌棉签蘸取细菌悬液，均匀涂满TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001% NAD)表面；用灭菌镊子夹取药敏纸片均匀贴于TSA平板上，置于5% CO2培养箱37 ℃培养36 h，测量抑菌圈直径大小，参照药敏片说明书进行结果判定，包括敏感、中介和耐药。

2 结 果

2.1 菌株鉴定和分型鉴定

PCR扩增结果显示，参考菌株和6株临床菌株均扩增出1 090和490 bp 2条条带，大小和Hps、Hps血清7型目的条带一致(图1)，表明6株菌株均为Hps，血清型为7型。

M，DL2000 DNA Marker；1、2,菌株0007；3、4,菌株1436；5、6,菌株1437；7、8,菌株1532；9、10,菌株1565；11、12,菌株1624；13、14，菌株1678;15、16，阴性对照M，DL2000 DNA Marker；1 and 2,Strain 0007；3 and 4,Strain 1436；5 and 6,Strain 1437；7 and 8,Strain 1532；9 and 10,Strain 1565；11 and 12,Strain 1624；13 and 14，Strain 1678;15 and 16，Negative control图1 菌株血清型PCR鉴定Fig.1 Identification of serotype of strains by PCR

利用Mega 6.0软件，将受试菌株16S rRNA基因测序结果与GenBank数据库中获取的相近的基因序列进行比对分析，结果见图2。由图2可知，受试菌株与参考菌株0007核苷酸相似性在98.6%以上，与其他参考菌株核苷酸相似性在97.7%以上。菌株1436 与参考菌株0007核苷酸相似性最高，达100%；菌株1624与菌株1678核苷酸相似性最低，为97.7%。

图2 菌株16S rRNA基因核苷酸序列相似性分析Fig.2 Similarity analysis of the 16S rRNA gene nucleotide sequence of strains

由16S rRNA基因序列的系统发育树可知，菌株1624与其他菌株亲缘关系较远，单独构成一个分支；菌株1436、1437、1532、1565、1678和参考菌株0007及参考菌株在同一个大分支中，菌株1436与参考菌株0007亲缘关系最近；菌株1437、1532与参考菌株0007在一个小分支中，亲缘关系较近；菌株1565和1678亲缘关系较近，这2菌株分别与西班牙的CD7-3、CD8-1株亲缘关系近(图3)。说明，同一血清型不同菌株亲缘关系存在一定差异性。

图3 基于16S rRNA基因序列的系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rRNA gene sequence

2.2 毒力基因测定结果

通过毒力基因PCR扩增，临床菌株和参考菌株检测出了vta1、vta2、vta3、wza、nanH、ompP2、cdtA、cdtB、cdtC和espP2毒力基因(图4)，其中临床菌株1565和参考菌株0007毒力基因型一致，为vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株临床菌株毒力基因型一致，为vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+(表5)。

M,DL2000 DNA Marker；1～13,capd、vta1、vta2、vta3、wza、hhdA、hhdB、ompP2、nanH、cdtA、cdtB、cdtC和espP2基因M,DL2000 DNA Marker；1-13, capd,vta1,vta2,vta3,wza,hhdA,hhdB,ompP2,nanH,cdtA,cdtB,cdtC and espP2 genes,respectively图4 毒力基因PCR检测结果Fig.4 PCR results of virulence genes

表5 毒力基因检测结果

2.3 致病性试验结果

由表6可知，接种后，参考菌株0007组5只豚鼠均未表现任何临床症状，生长状态良好；1436株、1437株、1532株、1678株组均有1只出现被毛粗乱、反应迟钝、蜷缩发抖等症状，未发生死亡。1565株、1624株组有2只出现症状，未发生死亡；生理盐水对照组未出现任何症状；至试验结束后对发病豚鼠剖检，可见腹腔内有腹水、纤维素性渗出，程度不一。用心脏血液、肝脏触片，革兰氏染色镜检，均发现革兰氏阴性、长短不一的细丝状菌体。无菌采集试验组发病豚鼠的心脏血液、肝脏接种TSA平板(含5%的新生牛血清，0.001%的NAD)，37 ℃培养30 h后，分离获得和接种菌株相一致的单一细菌。

表6 致病性试验结果

2.4 药敏试验结果

选用18种常用抗菌药对参考菌株和受试菌株进行药敏试验，结果见表7。参考菌株和临床菌株表现出不同的耐药谱，均表现出多重耐药。所有菌株对头孢他啶和头孢噻呋敏感性好，只有1株临床菌株对头孢噻呋表现为中介；对强力霉素、氟苯尼考、氧氟沙星、恩诺沙星敏感性较好,分别有1～3株表现为中介或耐药；对青霉素、氨苄西林、阿莫西林、卡那霉素、红霉素、土霉素、四环素、环丙沙星、诺氟沙星敏感性差，均有3株以上菌株表现为中介或耐药；对新霉素、阿米卡星、替米考星敏感性最差，无菌株表现为敏感。

表7 药敏试验结果

3 讨 论

副猪嗜血杆菌病是养猪行业的重要细菌性病原之一，可单一病原感染发病，更多是作为继发病原感染猪群，引起混合感染，给养猪行业造成巨大经济损失[14]。Hps临床血清型较多，不同血清型菌株的毒力及致病性不同，临床感染发病情况也不尽相同。河南地区主要流行菌株为4、5、13和7型[15]，4、5和13型相关报道也较多，而先前普遍认为血清7型菌株为无毒力菌株，相关报道较少。近年来，Hps血清7型在临床病例中分离率明显增多，可能与Hps血清7型菌株在临床自然进化过程中菌株毒力增强有关。本试验以Hps血清7型参考菌株为对照，对河南地区6株Hps血清7型临床菌株进行分型鉴定、相似性分析、毒力基因、药敏试验及豚鼠致病性研究，与参考菌株相比，临床菌株在毒力基因、耐药表型方面均表型出一定的差异。分析可能是临床菌株受自然环境和宿主体内某些变化影响，导致菌株在宿主体内感染过程中个别毒力基因表达出现上调或下调；同时由于国内抗生素使用不规范，同一血清型不同菌株在不同猪场受到抗生素选择压力差异较大，导致同一血清的不同菌株临床耐药表型出现一定的差异。

通过16S rRNA基因序列相似性比对及发育树构建发现，6株Hps血清7型菌株与参考菌株相似性及亲缘关系表现出有一定的差异性，其中菌株1436与参考菌株相似性达100%，亲缘关系最近；菌株1624与参考菌株的相似性为98.6%，亲缘关系相对较远。这充分说明同一血清型同一地域分离的菌株也存在一定的差异性。

Hps的致病过程包括感染黏附、侵入宿主、逃避宿主的防御机制、在宿主体内繁殖并对组织产生损伤。该过程是菌体携带所有毒力基因协同参与的复杂过程，每个或每类毒力基因功能作用尚未研究清楚。本试验筛选检测的13个毒力基因是Hps的部分致病关键因子。capd基因编码一种多糖合成蛋白，与菌体荚膜的生物学功能有关。vta1、vta2、vta3属于三聚体自转运蛋白，与病原体逃避宿主免疫系统监视密切关系[16-18]。wza是与Hps荚膜多糖输出蛋白相关的基因，在菌株荚膜多糖转运过程中起重要作用，与菌体黏附和抗吞噬方面有重要关联。神经转氨酶nanH基因与细菌的氧化耐受能力有关，在细菌感染宿主过程重要作用。hhdA、hhdB基因是溶血素修饰蛋白基因，主要参与溶血素的分泌与修饰[16-17]。cdtA、cdtB、cdtC是细胞膨胀毒素，诱导细胞膨胀、细胞核扩大并最终凋亡，是Hps菌株直接发挥细胞毒性的重要武器。ompP2是一种孔蛋白，在Hps外膜中含量最多，与细菌抗吞噬、抗补体介导的血清杀菌作用有关。胞外丝氨酸蛋白酶espP2基因属于自转运蛋白基因，与细菌的黏附、入侵和细胞毒性有关，可介导生物被膜形成和血清抗性的产生等[18]。6株Hps血清7型共检测出2种毒力基因型，其中1株临床菌株与参考菌株相同，为vta1+vta2+vta3+wza+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+；另外5株临床菌株毒力基因型相同，为vta1+vta2+vta3+wza+ompP2+nanH+cdtA+cdtB+cdtC+espP2+。该结果与张青娴等[19]报道有一定差异。临床菌株ompP2基因表达出现明显上调，该基因主要与细菌抗吞噬、抗补体介导的血清杀菌有关，这可能与近年来Hps血清7型临床分离率增多有一定关联。6株临床菌株均分离于典型病例，说明菌株具有一定的致病性；豚鼠致病性试验也表明，6株临床菌株均可感染豚鼠发病，发病率为20%～40%，但死亡率为0。与张青娴等[20]报道Hps血清5型携带14个毒力基因，感染豚鼠发病率80%，死亡率40%比较，Hps血清7型对豚鼠有一定的致病性，但毒力明显较弱，与陶伟杰等[21]试验结果基本一致。毒力基因检测结合致病性试验，携带10种毒力基因的菌株与携带9种毒力基因的菌株相比，在致病性上没有明显差异，说明Hps的致病性不是毒力基因简单的累加，而是多个毒力基因协同参与复杂的动态结果，除本次检测的毒力基因外，可能还有其他毒力基因参与，同时细菌毒力基因在感染过程中启动表达会有一定差异，致病表型也会出现差异。毒力表型与毒力基因型有一定的相关性，但不完全一致，致病机制十分复杂，需更多试验进行深入研究。

抗生素仍是当前防控副猪嗜血杆菌病的有效途径，但由于养殖过程中抗生素长期滥用或不规范使用，导致细菌耐药性越来越严重，使得药物抗菌效果越来越差。从药敏试验结果可看出，菌株1678与参考菌株0007耐药谱相近外，其他菌株耐药谱均有一定差异。总体来说，参考菌株和临床菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感性好，这与史开志等[22]报道结果较一致；而对青霉素、氨苄西林等β-内酰胺类药物敏感性差，这与陶伟杰等[21]和田昊伦等[23]结果一致，而与Miani等[24]、邓同炜等[25]报道结果不同；对氟苯尼考敏感性较好，这与田昊伦等[23]、Zhao等[26]结果一致。受试菌株对氨基糖苷类、大环内酯类敏感性最差。此外，参考菌株和临床菌株均表现出耐3种以上药物的多重耐药现象。因此，生产实践中对临床分离菌株进行及时、准确的耐药性检测，筛选敏感药物，对防治该病具有重要意义。

4 结 论

Hps血清7型临床菌株和参考菌株表现出2种毒力基因型，临床菌株较参考菌株毒力有一定的增强，可引起20%～40%豚鼠感染发病，表现一定的临床症状，但不能致死豚鼠。临床菌株和参考菌株均对头孢他啶和头孢噻呋敏感性好；对强力霉素、氟苯尼考敏感性较好；但对新霉素、阿米卡星、卡那霉素、红霉素、替米考星耐药性较强，且均表现明显的多重耐药现象。该研究为Hps血清7型流行病学、致病机制研究奠定了基础，为Hps血清7型的临床防控提供了参考依据。