猪骨骼肌卫星细胞体外分离培养研究进展

喻宗岗，马海明，2

(1.湖南农业大学动物科学技术学院，长沙 410128；2.岭南现代农业科学与技术广东省实验室，广州 510640)

猪的解剖结构和生理特征与人相似，因此可以作为人类疾病研究的模型[1]。为比较病理模型的优劣，研究发现，猪假性肥大肌营养不良症(duchenne muscular dystrophy，DMD)模型的病理状态比鼠模型中更接近于人[2-3]。因此，猪肌肉疾病模型比小鼠模型更有优势。骨骼肌卫星细胞在出生后机体骨骼肌发育、维持和再生等生命活动中都发挥着重要的作用[4]。骨骼肌卫星细胞不仅是肌纤维细胞核的来源，而且能促进纤维的肥大[5-6]。被激活的骨骼肌卫星细胞可以诱导肌细胞增殖、分化，并促使肌细胞与肌纤维融合[7]。骨骼肌卫星细胞不仅有增殖分化的潜能，而且可被招募参与骨骼肌运动[8]，在肌纤维损伤修复和再生过程中发挥重要作用[9-10]。因此，骨骼肌卫星细胞也可以作为肌肉生长发育的良好体外研究模型[11]。

骨骼肌卫星细胞最早由Mauro[12]于1961年在青蛙腿肌上分离获得，它位于肌纤维质膜和基底膜之间[13]，主要分布于慢肌纤维中[14]。之后陆续建立了细胞自然贴壁培养法、荧光激活细胞分选法和磁珠激活分选法等方法。自然贴壁法耗时、低效，荧光激活分选法依赖昂贵的仪器，磁珠法获得的细胞活力低[15]。通过添加酶可以适当缩短分离时间，并获得高纯度、高活力的细胞，但是目前酶消化法仍存在酶使用种类、剂量、消化时间不统一，离心过滤时离心力和滤径大小不一、离心过滤次数不一致等问题。作者通过对分离骨骼肌卫星细胞的取材、消化、过滤、离心、体外培养、鉴定等基本步骤进行综述，期望为体外获得高纯度、高活力的猪骨骼肌卫星细胞，建立规范有效的分离方法提供参考。

1 骨骼肌卫星细胞分离

1.1 取材

1.1.1 取材部位 骨骼肌卫星细胞分离有直接分离法和肌纤维分离法2种。Doumit等[16]于1992年利用直接分离法首次从4～8周龄猪的半膜肌中分离出肌源卫星细胞；Bekoff等[17]于1997年利用肌纤维分离法在小鼠骨骼肌中分离获得肌源卫星细胞。Wilschut等[18]于2010年建立猪单纤维分离法，自此陆续从岗上肌[19]、趾长伸肌[20]、三角肌群[21]、背最长肌[22-24]、半腱肌、半膜肌[24-25]、股二头肌[26-27]、腓肠肌[28]、三头肌[29]、后腿肌、菱形肌[11,30]、第三腓骨肌[28]、胫骨前肌[4]等肌肉组织中分离出了猪骨骼肌卫星细胞(图1A)。因背最长肌相较四肢的小肌群更大，取材最容易，常被用于分离骨骼肌卫星细胞。

1.1.2 取材时期 分离猪骨骼肌卫星细胞的材料可取自胎儿期至幼龄期，如60胚龄[31-32]、1日龄[4,33]、3日龄[19,27]、4日龄[26,28]、5日龄[24]、7日龄[34]、4～6周龄[23]、1月龄[19]、2月龄[35]、5月龄[36]和25周龄[34](图1B)。其中最常用的是出生后1日龄猪，并且1～7日龄猪占到85%以上，最大日龄为25周龄。猪日龄越大肌肉的体积越大，取材相对越容易，然而，随着时间的延长肌肉中骨骼肌卫星细胞的数量越少，其增殖分化潜能也会越低，因此要获得足够数量且分化潜能高的骨骼肌卫星细胞应取材于1日龄猪背最长肌。另外，即使取自同时期的同一部位，不同品种骨骼肌卫星细胞的增殖能力也存在差别[37]，如中国大蒲莲猪骨骼肌卫星细胞的增殖能力高于长白猪[7]。

p60 d，60胚龄；d，出生后天数；w，出生后周龄；mon，出生后月龄p60 d,60 embryo age;d,Days after birth;w,Weeks after birth;mon,Months after birth图1 肌肉组织取样部位(A)和时期(B)及其使用百分率Fig.1 Sampling site (A) and period (B) of muscle tissues and their percentage of use

1.2 消化

根据分离猪骨骼肌卫星细胞使用酶的种类，将分离方法分为单酶消化法和多酶消化法，单酶有链酶蛋白酶[38-39]、胶原酶D[34]、蛋白酶[24,27,40-41]、蛋白酶ⅩⅣ[31,42]、胰蛋白酶[25,43-44]、Ⅰ型胶原蛋白酶[45-52]、Ⅱ型胶原蛋白酶[7,29,53-63](图2)。Ⅱ型胶原蛋白酶是最常用的酶，不同的酶有最佳的使用方法。Ⅱ型胶原蛋白酶能有效消化肌肉组织中的结缔组织，用0.2% Ⅱ型胶原蛋白酶消化2 h最佳(图3A、3D)。Ⅰ型胶原蛋白酶最佳使用方法是0.2%消化1～2 h(图3B、3E)。蛋白酶使用量有4种规格(图3C)，最佳消化时间是1 h(图3F)。

图2 消化酶及其使用百分率Fig.2 Digestive enzymes and their percentage of use

联合使用2种酶的方法有胶原酶+Ⅹ型胰蛋白酶[19]、Ⅰ型胶原酶+胰蛋白酶[4,23,64-65]、Ⅱ型胶原酶+胰蛋白酶[66]、蛋白酶+Ⅺ型胶原蛋白酶[67-68](图2)，其中，0.1%～0.2%Ⅰ型胶原酶+0.25%胰蛋白酶应用最多，也有联合使用胰蛋白酶+胶原酶+DNA酶3种酶分离骨骼肌卫星细胞的[11,24]。罗桂芬等[21]比较了链霉蛋白酶、胰酶及胶原酶消化法的分离效果，发现链酶蛋白酶消化法与其他酶消化法相比，可获得数量最多的骨骼肌卫星细胞，但细胞活力没有差异。因为不同的酶作用于不同的底物，胶原蛋白酶主要作用于肌束，链酶蛋白酶和胰蛋白酶作用于基底膜和肌膜，促使骨骼肌卫星细胞的释放[69]。联合使用多种酶消化肌肉组织中的异质物，虽然能有效去除杂质，但是延长了消化时间。1日龄猪肌肉组织中含有最多的是结缔组织，因此使用Ⅱ型胶原蛋白酶是最有效的分离方法。

A、D，分别为Ⅱ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率；B、E，分别为Ⅰ型胶原蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率；C、F，分别为蛋白酶的使用浓度和消化时间使用百分率A and D，The concentration of type Ⅱ collagenase and the percentage of digestion time respectively;B and E,The usage percentage of concentration and digestion time of type Ⅰ collagenase,respectively;C and F,The usage percentage of protease concentration and digestion time,respectively图3 3种常用单酶使用条件Fig.3 Application conditions of three common single enzymes

1.3 过滤和离心

骨骼肌中包含血管、神经等结缔组织(图4)，分离肌卫星细胞时需要过滤和离心除去结缔组织以获得高纯度的细胞。分离猪骨骼肌卫星细胞有不过滤、过滤1次和过滤多次3种方式(图5A)。1次过滤有20 μm[19,26]、40 μm[35,41,68]、70 μm[4]、100 μm[27,70]、100目[70]和300 mm[46]等多种滤径参数(图5B)。2次过滤有100 μm+40 μm[34,67,71]、100 μm+70 μm[11,30,57]、200目+400目[55-56,59,66]、200 mm+50 mm[53,60,62]、200 μm+70 μm[45]、70 μm+40 μm[31,42]、76 μm+37 μm[72]、500 μm+53 μm[38]7种(图5C)，其中200目+400目在2次过滤中应用最广泛。3次过滤有100 μm+70 μm+40 μm[29,48,58,61,64]和100目+200目+400目[73]2种；其中100 μm+70 μm+40 μm是3次过滤的最佳方式(图5C)。1次过滤虽然省时，但可能因过滤不足得到的细胞不纯；3次过滤不仅延长了时间，还可能因过度过滤损伤细胞而降低细胞活力。因此，最优的过滤方式是200目+400目2次过滤法。

普通离心和密度梯度离心是骨骼肌卫星细胞常见的2种分离方式。普通离心有1次离心和多次离心2种，多次离心有多次单一离心力和多次不同离心力2种。300×g离心5 min(2次)[35]比1 000 r/min离心10 min然后1 000 r/min离心5 min[47](图5D)时间短，相同分离效果下更为简便。多次不同离心力中(图5E)，2 000 r/min离心5 min后1 000 r/min离心10 min[74]比300×g离心6 min后800×g再离心10 min[39]用时少，故而更简捷。在用时上，3次离心中，1 500×g离心10 min、800×g离心10 min、800×g离心5 min比100×g离心5 min、1 000×g离心5 min(2次)[34]用时长，比1 200×g离心15 min、300×g离心5 min、1 200 g离心15 min[27]用时短，但是先高离心力能有效去除大块碎屑，再低离心力去除细微杂质，还不至损伤细胞，造成细胞活力下降，是最好的3次离心法。Percoll密度梯度离心有3种70%、50%、40%[26,43]，70%、50%、40%、25%[26,44]和60%、20%[11,30](图5F)，其中60%、20%密度梯度离心法因为成分较其他2种更简单，因此最简便。1次和2次离心虽能去除大部分被消化的结缔组织，但是仍有残留，所获的细胞不纯，因此，要有效去除杂质，3次离心法是最佳选择。

图4 骨骼肌结构模式图[33]Fig.4 Skeletal muscle structure model diagram[33]

A，过滤次数使用百分率；B，1次过滤使用百分率；C，多次过滤使用百分率；D，1次离心使用百分率；E，多次离心使用百分率；F，密度梯度离心使用百分率A,The percentage of filtering times;B,The percentage of single filtration;C,The usage percentage of multiple filtration;D,The percentage of single centrifugation;E,The percentage of multiple centrifugal use;F,The percentage of density gradient centrifugation图5 过滤和离心程序及其使用百分率Fig.5 Filtration and centrifugation procedures and their percentage of use

2 骨骼肌卫星细胞培养

根据分离目标分为成肌细胞、骨骼肌卫星细胞分离法和单纤维分离法。常用成肌细胞、骨骼肌卫星细胞分离法来获得原代细胞。有研究比较了单核成肌细胞分离法和单纤维分离法获得骨骼肌卫星细胞的优劣，结果发现单核成肌细胞分离法无法得到同质性高的成肌细胞，且其中的肌卫星细胞数量少，再生能力差；单纤维分离法得到的卫星细胞细胞增殖能力更强，且可以了解骨骼肌卫星细胞初始位置和迁移转化等过程[20]。也有通过共培养骨骼肌卫星细胞和基质血管细胞来获得骨骼肌卫星细胞的方法[75]。

离心后的细胞中含有成肌细胞和骨骼肌卫星细胞，为获得单一的骨骼肌卫星细胞还需进一步分离纯化。成肌纤维细胞贴壁早于肌卫星细胞，利用差速贴壁的特性，即可以获得成肌细胞和肌卫星细胞[75-76]。体外培养猪肌卫星细胞的培养液包含基础培养基、血清、抗生素和其他添加物等多种物质。对46篇文献的培养液分析归纳获得如下结果。

猪肌卫星细胞的培养基有6种，使用频次最高的是DMEM/F12(图6A)。血清因其中含有细胞生长必需的成分常被添加在培养基中，常见的添加方式有添加1种血清和添加2种血清。添加10%胎牛血清(FBS)比添加20% FBS更经济。10% FBS+10%马血清(HS)和10% FBS+10%猪血清(PS)使用较少(图6B)。为防止外源微生物的污染，常在培养基中添加抗生素。在46篇研究中只有7篇未添加抗生素，抗生素使用率达到84%以上(图6C)。在添加抗生素的报道中，1%青-链霉素(P/S)是必需成分，也有同时添加了青-链霉素和两性菌素[11,26,28-30,43,47,49]，还有同时添加了青-链霉素、两性菌素和庆大霉素[44]。在培养液中添加谷氨酰胺和谷氨酰胺丙氨酸二肽可提高细胞的活性、促进细胞生长。部分还添加了基础成肌纤维细胞生长因子(bFGF)、鸡胚提取物(CEE)、氨基酸(AA)、4-羟乙基哌嗪乙磺酸(HEPES)和表皮生长因子(EGF)等物质(图6D～6H)，其中bFGF、CEE和EGF可提高细胞的贴壁率，AA为细胞生长提供营养，HEPES保证细胞生长的缓冲能力。在培养液中添加胞外基质(如明胶、鼠尾胶原、多聚赖氨酸、层黏连蛋白和纤维黏连蛋白)可有效提高细胞的贴壁率[77]。对于没有损伤的细胞，有自然贴壁的能力，不用添加促贴壁的物质，增加添加物后细胞渗透压和缓冲力会改变还需要添加缓冲液，因此，DMEM/F12+10% FBS+1% P/S是猪骨骼肌卫星细胞培养的最佳培养液。

①A，基础培养基使用百分率；B，血清使用百分率；C，抗生素使用百分率；D，谷氨酰胺使用百分率；E，基础纤维生长因子使用百分率；F，鸡胚提取物使用百分率；G，氨基酸使用百分率；H，其他添加物的使用百分率。②DMEM，杜氏改良伊戈尔培养基；FBS，胎牛血清；HS，马血清；PS，猪血清；FCS，小牛血清；PS，青-链霉素；Amp，两性菌素；GTM，庆大霉素；bFGF，基础成肌纤维细胞生长因子；CEE，鸡胚提取物；NEAA，非必需氨基酸；AA，氨基酸；HEPES，4-羟乙基哌嗪乙磺酸；EGF，表皮生长因子；None,在46篇文献中未使用该物质①A,The used percentage of basic medium;B,The used percentage of serum;C,The used percentage of antibiotics;D,The used percentage of glutamine;E,The used percentage of basic fiber growth factor;F,The used percentage of chicken embryo extract;G,The used percentage of amino acids;H,The used percentage of other additives. ②DMEM,Dulbecco’s modified Eagle’s medium；FBS,fetal bovine serum；HS,Horse serum；PS,Porcine serum；FCS,Fetal calf serum；P/S,Penicillin-streptomycin；Amp,Amphotericin；GTM,Gentamicin；bFGF,Basic fibroblast growth factor；CEE,Chicken embryo extract；NEAA,Nonessential amino acid；AA,Amino acid；HEPES,4-hydroxyethyl piperazine ethanesulfonic acid；EGF,Epidermal growth factor；None,The substance was not used in 46 literatures图6 培养液各组分及其使用百分率Fig.6 Components of culture medium and their percentage of use

3 骨骼肌卫星细胞的鉴定

骨骼肌卫星细胞是多潜能干细胞，可以分化为成肌细胞和成脂细胞，因此可以使用成肌或成脂标志物来鉴定。根据标志基因在细胞中的位置可分为核标记、转录因子标记和细胞表面膜蛋白标记[78]。常见的核标记有配对盒基因3(PAX3)、PAX7；转录因子标记有生肌调节因子5(Myf5)、Myf4、肌分化因子(MyoD)、肌细胞生成素(MyoG)等，表面膜蛋白主要有m-钙黏蛋白、α7-和β1-整合素、c-Met、C-X-C趋化因子受体4型(CXCR4)、多配体蛋白聚糖-3和多配体蛋白聚糖-4、降钙素受体、颅脑损伤蛋白-1、CD34、血管细胞黏附分子-1(VCAM1)和神经细胞黏附分子-1 (NCAM1)[79-80]。肌卫星细胞标志基因有PAX7[7,43,47,53,56,60,63,66,81-83]和Myf5[27,40,67,84]，成脂标志基因有脂蛋白脂酶(LPL)、过氧化物酶体增殖物激活受体(PPARγ)、脂肪细胞和定向分化因子1(ADD1)和固醇调节元件结合蛋白-1(SREBP-1)[67]，成肌标志基因有PAX7[27,28,34]、MyoD、MyoD1[4,26-28,67,85]、MyoG[26,28,85]、Myf5[27,28,33,34]、肌球蛋白重链(MHC)[24]和结蛋白(Desmin)[4,24,28,30,55]。PAX7是鉴定骨骼肌卫星细胞的最佳因子。

免疫荧光(IF)、实时荧光定量PCR(qPCR)、流式细胞分析(FC)和免疫组化(IHC)是常用的鉴定方法(图7)。不同的鉴定因子因其表达的部位和鉴定的简便及有效性的不同而有所侧重。Desmin使用IHC法鉴定最为有效(图8A)，Myf5用IF法鉴定效果最好(图8B)。MyoD的鉴定方式中qPCR法相较IF法更为方便、经济，因此被广泛使用(图8C)。PAX7使用IF法鉴定最有效(图8D)。成脂细胞标志基因常用PCR法来鉴定，还可以使用油红O染色法来鉴定[51]。相较于Desmin、Myf5和MyoD，PAX7在卫星干细胞、卫星细胞和成肌细胞上均有表达(图9)，因此是最佳的鉴定因子。

图7 鉴定方法及其使用百分率Fig.7 Identification methods and their percentage of use

图8 标记因子的鉴定方法及其使用百分率Fig.8 Identification method and application percentage of marker factors

图9 参与调控肌卫星细胞生长变化过程的标记因子[33]Fig.9 Marker factors involved in regulating the growth and changes of muscle satellite cells[33]

4 小 结

猪骨骼肌卫星细胞可以从不同时期的多种肌肉中分离，且各时期分离细胞的数量和增殖能力不同，部位决定着取材的便捷性，因此，常用1日龄猪的背最长肌分离猪骨骼肌卫星细胞。酶消化涉及到用酶种类及各酶使用方法，酶种类的增加可以有效去除肌肉中的杂质，但延长了消化时间，很可能因过度消化损伤细胞膜，降低细胞活力，所以使用单酶是比较保险的选择。0.2% Ⅱ型胶原蛋白酶37 ℃消化2 h是最有效的消化方式。消化后的肌肉组织是细胞和异质碎屑的混合物，需要通过过滤和离心去除组织碎屑，获得纯细胞。单次过滤、单次离心难以有效去除杂质，多次过滤、离心可能会损伤细胞膜降低细胞活力，因此2次过滤加3次离心是最佳选择，即400目+200目过滤，1 500×g离心10 min、800×g离心10 min、800×g离心5 min是最佳组合。

过滤离心后的细胞还包含成肌细胞，因此需进一步培养纯化获得单一的骨骼肌卫星细胞。成肌细胞在培养液中正常生长后会较早贴壁，因此可取贴壁后的上清继续培养来获得骨骼肌卫星细胞。培养液对细胞的正常生长至关重要，原代细胞在离体环境中需要充足的营养和无菌环境，DMEM/F12+10% FBS+1% P/S是细胞培养的常见培养液。骨骼肌卫星细胞可通过核标志、转录标志和膜表面标志等标志基因或卫星细胞标记、成肌细胞标记和成脂细胞标记因子来鉴定，PAX7基因广泛表达于肌卫星细胞和成肌细胞，因此是最佳的鉴定基因。尽管qPCR、FC、IF和IHC等方法均可用来鉴定，但IF法更为直观和准确，因此广泛被使用。

为获得纯度、活力和分化潜能更高的猪骨骼肌卫星细胞，还需要规范和优化取材、消化、过滤、离心、培养和鉴定等步骤，建立简便有效的体外分离培养程序。随着新的鉴定方法的出现和新技术的普及，猪骨骼肌卫星细胞的分离培养也将更加高效便捷。