河南省信阳市鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和血清型分析

2014-07-18焦凤超李迎晓陈宏智肖世文

江苏农业科学 2014年1期

焦凤超　李迎晓　陈宏智　肖世文

摘要：对河南省信阳市送检的疑似鸭疫里默氏杆菌感染病鸭进行病原菌的分离鉴定。根据培养特性和生化鉴定结果分离出6株鸭疫里默氏杆菌；经平板凝集试验确定出血清1型1株，血清2型2株，另外3株未定型；人工感染试验表明，分离菌株对樱桃谷肉雏鸭有很强的致病性。

关键词：鸭疫里默氏杆菌；血清型；致病性

中图分类号： S858.322.61文献标志码： A文章编号：1002-1302（2014）01-0166-02

收稿日期：2013-05-17

基金项目：河南省科技攻关项目（编号：122102110022）。

作者简介：焦凤超（1979—），男，河南西平人，硕士，讲师，从事病原微生物与免疫学研究。E-mail：fengchaojiao@163.com。鸭疫里默氏杆菌病是由鸭疫里默氏杆菌（Riemerella anatipestifer）引起鸭、鹅、火鸡以及其他鸟类的一种接触传染病[1]，别称鸭传染性浆膜炎，主要侵害2～8周龄的雏鸭，呈急性或慢性败血症，其特征是纤维素性心包炎、肝周炎、气囊炎、脑膜炎，也可能发生无任何临床症状的呼吸道感染，发病率5%～90%，死亡率高达90%[2]。由于该菌血清型众多，各血清型间无交叉保护作用且存在地域差异，所以导致目前疫苗的免疫预防效果不是十分理想。本研究通过对河南省信阳市部分地区疑似鸭疫里默氏杆菌的分离鉴定和血清型分析，以期为该地区鸭疫里默氏杆菌病的免疫预防提供参考。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1病料病料取自河南省信阳市送检的10份鸭疫里默氏杆菌病疑似病例的脑、心血、肝、脾等组织。

1.1.2菌株及阳性血清鸭疫里默氏杆菌1、2型菌株和标准血清由华中农业大学赠送。

1.1.3主要培养基麦康凯琼脂、TSA、TSB等培养基购自浙江杭州天和微生物试剂有限公司；小牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司。

1.1.4细菌微量生化管细菌微量生化管购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.1.5试验动物试验用健康樱桃谷肉雏鸭购自河南华英集团公司。

1.2方法

1.2.1病原菌分离无菌采集病死鸭的脑、心血、肝脏等病料，划线接种到TSA（含5%小牛血清）培养基和麦康凯培养基上，置于烛缸内37 ℃培养24 h，观察细菌的生长情况。在TSA培养基上生长而不能在麦康凯培养基上生长的菌落为可疑鸭疫里默氏杆菌，挑取单菌落在TSA（含5%小牛血清）培养基上进行纯化培养，待进一步鉴定[3]。

1.2.2病原菌染色镜检挑取TSA平板上单个可疑菌落，进行革兰氏和瑞氏染色，镜检观察形态。

1.2.3生化试验按程安春等的方法[4]采用微量发酵管（添加10%小牛血清）进行常规生化试验。

1.2.4病原菌血清学鉴定参照程安春等的方法[5]，将分离的病原菌株纯培养物进行平板凝集试验：在干净载玻片中央滴加纯化水1滴，用接种环蘸取经过离心洗涤的分离菌少许，与纯化水混匀，滴加未稀释的阳性血清1滴。将载玻片反复振荡或用接种环涂开，注意观察结果。几秒钟后出现清晰的乳白色絮状凝集块者即判定为阳性反应。阳性反应者须重复3次上述操作以减少假阳性。

1.2.5人工感染试验将确定血清型的分离菌纯化后，分别接种于加有5%小牛血清的TSB液体培养基上，37 ℃振荡培养24 h后进行纯粹性检验、细菌比浊计数，活菌含量约为 10亿CFU/mL。取未免疫过鸭疫里默氏杆菌灭活疫苗的14日龄健康樱桃谷鸭作为试验对象（每组10羽）。试验组以分离菌纯培养物0.1 mL/羽接种，含菌数为1亿CFU，第7组为对照组，接种等量的生理盐水。接种后观察10 d，记录发病和死亡情况[6]。

2结果与分析

2.1细菌分离结果

试验表明，从10例鸭疫里默氏杆菌病疑似病例的脑、心血、肝、脾等组织中分离出6株疑似菌株，依次命名为XY1、XY2、XY3、XY4、XY5、XY6。6株鸭疫里默氏杆菌分离株均呈革兰阴性、不运动、无芽孢、单个或成双存在、偶见长丝状的短小杆菌，瑞氏染色呈两极浓染，符合鸭疫里默氏杆菌的形态特征。

2.2生化试验结果

分离菌均不发酵葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、乳糖、甘露醇、阿拉伯糖、山梨醇等碳水化合物，靛基质试验、甲基红试验、尿素酶试验、硝酸盐还原试验均为阴性，不产生硫化氢、液化明胶、过氧化氢酶阳性。基本符合鸭疫里默氏杆菌的生化特性。

2.3血清型鉴定结果

将分离到的6株细菌分别与标准阳性血清进行平板凝集试验，结果表明XY1、XY3均与抗鸭疫里默氏杆菌2型阳性血清发生凝集反应；XY2与抗鸭疫里默氏杆菌1型阳性血清发生凝集反应；XY4、XY5、XY6未定型。

2.4人工感染试验结果

试验组樱桃谷雏鸭接菌24 h后开始出现精神沉郁、行动迟缓、排绿色稀粪、共济失调等症状，3～5 d全部发病死亡。剖检死鸭发现，其患有或轻或重的纤维素性心包炎、气囊炎、肝周炎；并对死鸭进行细菌分离，结果重新分离到接种菌，并能凝集相应血清型的鸭疫里默氏杆菌。对照雏鸭均健存。

3结论与讨论

目前鸭疫里默氏杆菌已呈全球性分布[7]。2002年前，学者普遍认为鸭疫里默氏杆菌有21个血清型。2003年程安春等提出4个新的血清型存在，命名为22～25型[4]。2006年张大丙等提出血清10型还存在4个亚型，并鉴定出1个变异株以及2个可能的新型菌株[8]。因此鸭疫里默氏杆菌实际存在的血清型可能更复杂，且各血清型间的交叉保护性不强[9-12]。本研究参照程安春等介绍的平板凝集方法[5]共分离鉴定出6株鸭疫里默氏杆菌，其中3株为血清1型或血清2型，另外3株未定型，说明信阳市鸭群存在包括血清1型和血清2型在内的多种血清型感染。由于采集病料和标准菌株、标准血清的局限，其他流行的血清型有待进一步分离和鉴定。

由于该菌血清型众多，且各地区流行的鸭疫里默氏杆菌优势血清型存在差异，使疫苗免疫预防效果不尽如人意，因此许多养殖户纷纷放弃了疫苗转而依靠使用药物防治该病发生，从而导致了兽药滥用、养殖成本增加以及耐药菌株不断增多，给食品安全带来了很大的隐患。因此，选择适合当地血清型的鸭疫里默氏杆菌菌苗或进行自家疫苗的研制是防治该病的关键。发病鸭群采用药物治疗时也应根据本场分离菌株的药敏试验结果，选择高敏药物，避免超量或滥用抗生素，以减少耐药菌株的产生，降低食品药物残留的风险。

参考文献：

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[2]卡尔尼克. 禽病学[M]. 10版.北京：北京农业大学出版社，1991：153-157.

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[4]程安春，汪铭书，汪开毓，等. 现代禽病诊断和防治全书[M]. 成都：四川大学出版社，1997.

[5]程安春，汪铭书，陈孝跃，等. 我国鸭疫里默氏杆菌血清型调查及新血清型的发现和病原特性[J]. 中国兽医学报，2003，23（4）：320-323.

[6]王明俊. 兽医生物制品学[M]. 北京：中国农业出版社，1997.

[7]纪丽莎，林燕，张志彦，等. 鸭疫里氏杆菌病的诊断与防治进展[J]. 江苏农业科学，2012，40（2）：174-176.

[8]张大丙，郑献进，曲丰发. 鸭疫里默氏菌一个可能新型的鉴定[J]. 中国预防兽医学报，2006，28（1）：98-100.

[9]张大丙，曲丰发，郑献进. 鸭疫里默氏菌血清型的研究概况[J]. 中国兽医杂志，2006，42（11）：38-40.

[10]刘运镇，陈高，徐婷婷，等. 苏中地区鸭疫里氏杆菌血清型鉴定和药敏试验[J]. 江苏农业科学，2013，41（2）：185-187.

[11]李婧，朱瑞良，李舫，等. 山东地区3型鸭疫里氏杆菌的分离鉴定及主要生物学特性研究[J]. 中国动物传染病学报，2009，17（3）：49-54.