抗菌药物联合中药单体对泛耐药鲍曼不动杆菌生物被膜的影响

孟千琳 彭勤 凌保东,*

(1 成都医学院结构特异性小分子药物研究四川省高校重点实验室，成都 610500；2 成都医学院药学院，成都 610500；3 南充市中心医院，南充 637000)

近年来，全球泛耐药鲍曼不动杆菌(extensively drug resistant,XDRAB)检出率急剧增加，已被世界卫生组织(WHO)列入ESKAPE家族的最高级别耐药病原体之一[1-2]，其中XDRAB生物被膜的形成作为重要的毒力因素[3-4]，通过阻止抗菌药物的渗入、抵抗宿主免疫系统、保护休眠菌，甚至导致全耐药细菌出现，使顽固性感染难以治愈[5-6]。因此，迫切需要从新的角度对细菌耐药机制进行研究，寻找新的防治策略与方法。笔者前期研究表明抗菌药物与中药单体组合用药对XDRAB具有逆转耐药性作用[7]，本研究拟深入探讨这种逆转XDRAB耐药性作用是否与生物被膜的抑制作用相关，以期为临床防治XDRAB感染提供新的实验依据。

1 材料与方法

1.1 试验药物

4种抗菌药物：多黏菌素B(批号：J0716A，含量: ＞6500 IU/mg)、亚胺培南(M0502A，含量＞95%)、美罗培南(M0108A，含量＞98%)、替加环素(F1208A，含量＞98%)；3种中药单体：黄芩苷(大连美仑生物公司，批号：M0515A，含量: ≥95% )、盐酸小檗碱(大连美仑生物公司，批号：J1202A，含量:≥97%) 、槲皮素二水物( 上海源叶生物科技有限公司，批号: C13A9Y58602，含量: ≥95% ) ;

1.2 菌株

2018—2019年成都医学院第一附属医院不同科室的临床标本分离的XDRAB 9株，其中临床分布重症医学科5株，呼吸科2株，老年医学科1株，急诊科1株，质控菌大肠埃希菌DH5α为本实验室留存。

1.3 试剂

胰蛋白胨大豆肉汤培养基(批号：20200815青岛海博生物技术有限公司)、MH肉汤培养基(批号：MB0148大连美仑生物公司)、磷酸缓冲液(批号：20201228上海生工生物工程有限公司)

1.4 仪器

恒温培养箱(上海一恒科技有限公司)、生物安全柜(Thermo Fisher Scientific公司)、酶标仪(伯腾仪器有限公司)。

1.5 方法

1.5.1 抗菌药物、中药单体对XDRAB生长的影响

使用96孔细胞培养板，每株菌设置6个复孔，每孔加入20 μLA600=0.12的菌液和170 μL TSB培养基，模型对照组加入10 μL PBS，实验组加入10 μL对应浓度的药液，37℃，孵育24 h，每隔4 h测一次A600值，利用比浊法检测24 h内4种抗菌药物及3种中药单体在1、1/2、1/4、1/8和1/16×MIC的浓度下对9株XDRAB生长的影响，最终选择不抑制细菌生长的药物浓度作为后续实验的工作浓度。

1.5.2 抗菌药物、中药单体单用及组合用药对XDRAB生物被膜的影响

菌液的制备：接种细菌于L B 固体培养板，37℃细菌培养箱孵育16～20 h，挑取3～5颗单克隆于200 μL 0.9%生理盐水中进行混匀，取100 μL于酶标仪测定A600值，最终通过加入0.9%生理盐水调整至A600=0.12，细菌含量达到1×108CFU/mL。XDRAB生物被膜形成能力的检测：使用96孔细胞培养板，阴性对照组选取无生物被膜形成能力的大肠埃希菌DH5α菌株，设置6个复孔，每孔依次加入180 μL的TSB培养基和20 μLA600=0.12的菌液，37℃，孵育24 h。去除培养基后用200 μL PBS清洗3遍，空气干燥20 min，0.1%结晶紫染色20 min，去除结晶紫，重复3遍，最后加入95%乙醇，酶标仪下测定570 nm的吸光度A。生物被膜形成能力判定标准为:①BF阴性：A模型对照≤A阴性对照，②BF阳性：A模型对照＞A阴性对照，结晶紫棋盘染色法(crystal violet staining,CVS)：参照文献[8-9]的实验方法，并稍作调整，使用96孔细胞培养板，每株菌设置6个复孔，药物浓度选择不抑制细菌生长的浓度，以此浓度为基础进行倍比稀释，设置高、中、低3个浓度梯度。将4种特殊使用级抗菌药物分为A1、A2、A3、A4；3种中药单体分为B1、B2、B3。以A1和B1组合为例进行药物分组：①药物单用组：A1浓度分别为(A1高浓度)、(A1中浓度)、(A1低浓度)；B1浓度分别为(B1高浓度)、(B1中浓度)、(B1低浓度)；②药物联用组：A1和B1的3个浓度分别两两组合，得到A1与B1联合应用的9个浓度组合，综上通过棋盘组合法比较药物单用和联用时各个浓度下对XDRAB生物被膜的抑制作用。空白对照组加入180 μL TSB培养基，药物单用组加入170 μL TSB培养基、对应浓度的药液10 μL，药物联用组加入160 μL TSB培养基、两个组合浓度的药液各10 μL，最后加入A600为0.12的细菌重悬液20 μL，总体系为200 μL，37 ℃，孵育24 h，吸出培养基后用200 μL PBS清洗3遍，空气中干燥20 min，每孔加入200 μL 0.1%结晶紫染色20 min，吸出结晶紫，重复PBS清洗3遍，空气干燥20 min，加入95%乙醇溶解，酶标仪测定570 nm下吸光度A，生物被膜抑制率(%)=[1-(药物组吸光度A/模型对照组吸光度A)]×100。

1.5.3 统计学处理

运用SPSS26.0t检验和Graphpad Prism 8.0.1分别进行数据统计和作图，计量资料以(±s)表示，以P＜0.05具有统计学意义。

2 结果

2.1 抗菌药物、中药单体对XDRAB生长的影响

结果显示(图1)，与模型对照组相比，亚胺培南(4 μg/mL)、美罗培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加环素(0.0625 μg/mL)、黄芩苷(128 μg/mL)、盐酸小檗碱(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)，在24 h内不抑制细菌的生长，将该浓度作为后续实验的工作浓度。

2.2 抗菌药物、中药单体单用及组合用药对XDRAB生物被膜的影响

与阴性对照组相比，9株XDRAB均会形成生物被膜，药物浓度选择见“2.1”，以此浓度为基础进行倍比稀释，设置高、中和低3个浓度梯度，药物浓度分组见表1。与模型对照组相比，4种抗菌药物、3种中药单体在各自高浓度下单用均能够明显抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制作用槲皮素二水物＞替加环素＞美罗培南＞盐酸小檗碱＞多黏菌素B＞黄芩苷＞亚胺培南，4种抗菌药物分别和3种中药单体在高浓度下联合用药对XDRAB生物被膜抑制效果均明显优于单独用药(P＜0.05)，结果见表2，其中替加环素与黄芩苷的9个浓度组合均能够显著抑制XDRAB生物被膜的形成(P＜0.05)，抑制效果均比替加环素、黄芩苷分别对应浓度单用时的作用强(P＜0.05),在替加环素(0.015625 μg/mL) +黄芩苷(32 μg/mL)的浓度组合下，药物剂量最小，结果见表3和图3。

表1 4种抗菌药物和3种中药单体对9株XDRAB生物被膜抑制的工作浓度分组(μg/mL)Tab.1 The working concentration group of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of traditional Chinese medicine monomers on 9 XDRAB biofilm inhibition (μg/mL)

表2 4种抗菌药物、3种中药单体单用、联用对9株XDRAB生物被膜形成的影响(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表2 4种抗菌药物、3种中药单体单用、联用对9株XDRAB生物被膜形成的影响(±s,n=9)Tab.2 The activity of 4 kinds of antibacterial agents and 3 kinds of Chinese medicine monomers on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

"-"：该浓度药物对生物被膜的抑制率与空白组一致

药物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)显著性差异(与空白组比较)BF抑制药物(μg/mL)生物被膜形成能力(A570)显著性差异(与空白组比较)BF抑制率/%(与空白组比较)XDRAB(n=9)PXDRAB(n=9)P率/%(与空白组比较)空白1.125±0.373小檗碱(16)0.864 ±0.107＜0.0523.2阴性对照0.410±0.030小檗碱(8)1.120 ±0.064＞0.05-亚胺培南(4)0.720±0.154＜0.0136.0槲皮素(64)0.512 ±0.049＜0.0154.5亚胺培南(2)0.874±0.183＜0.0522.4槲皮素(32)0.734±0.075＜0.0134.8亚胺培南(1)0.980±0.190＞0.0512.9槲皮素(16)0.861 ±0.081＜0.0523.5美罗培南(2)0.616±0.191＜0.0145.3亚胺培南(4) /黄芩苷(128)0.437 ±0.063＜0.0161.2美罗培南(1)0.846±0.175＜0.0524.8亚胺培南(4)/小檗碱(32)0.512 ±0.138＜0.0154.5美罗培南(0.5)0.902±0.173＜0.0520.0亚胺培南(4)/槲皮素(64)0.410 ±0.042＜0.0163.6多黏菌素B(0.25)0.682±0.129＜0.0139.4美罗培南(2) /黄芩苷(128)0.402 ±0.081＜0.0164.3多黏菌素B(0.125)0.919±0.098＜0.0518.4美罗培南(2)/小檗碱(32)0.384 ±0.094＜0.0166.0多黏菌素B(0.0625)1.034±0.101＞0.058.1美罗培南(2)/槲皮素(64) 0.376 ±0.041＜0.0166.6替加环素(0.0625)0.598 ±0.068＜0.0146.9多黏菌素B(0.25) /黄芩苷(128) 0.582 ±0.099＜0.0148.3替加环素(0.03125)0.780 ±0.084＜0.0130.7多黏菌素B(0.25)/小檗碱(32) 0.507 ±0.099＜0.0155.0替加环素(0.015625) 0.918 ±0.086＜0.0518.4多黏菌素B(0.25)/槲皮素(64) 0.450 ±0.108＜0.0160.0黄芩苷(128)0.704 ±0.082＜0.0137.5替加环素(0.0625) /黄芩苷(128) 0.412 ±0.101＜0.0163.4黄芩苷(64)0.887 ±0.053＜0.0521.2替加环素(0.0625)/小檗碱(32) 0.456 ±0.071＜0.0159.5黄芩苷(32)0.894 ±0.072＜0.0520.6替加环素(0.0625)/槲皮素(64) 0.398 ±0.079＜0.0164.7小檗碱(32)0.660 ±0.117＜0.0141.4

表3 替加环素与黄芩苷联用对9株XDRAB生物被膜形成的影响(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

表3 替加环素与黄芩苷联用对9株XDRAB生物被膜形成的影响(±s,n=9)Tab.3 The activity of tigecycline and baicalin on the formation of 9 XDRAB biofilms(±s,n=9)

生物被膜形成能力(A570)显著性差异(与空白组比较)药物(μg/mL)BF抑制率/%(与空白组比较)XDRAB(n=9)P空白1.125±0.373阴性对照0.410±0.030替加环素(0.0625)/黄芩苷(128)0.412 ±0.101＜0.0163.4%替加环素(0.03125)/黄芩苷(128)0.474 ±0.067＜0.0157.9%替加环素(0.015625)/黄芩苷(128)0.512 ±0.055＜0.0154.5%替加环素(0.0625)/黄芩苷(64)0.519 ±0.120＜0.0153.9%替加环素(0.03125)/黄芩苷(64)0.592 ±0.110＜0.0147.4%替加环素(0.015625)/黄芩苷(64)0.668 ±0.105＜0.0140.7%替加环素(0.0625)/黄芩苷(32)0.579 ±0.124＜0.0148.6%替加环素(0.03125)/黄芩苷(32)0.639 ±0.133＜0.0143.2%替加环素(0.015625)/黄芩苷(32)0.779 ±0.120＜0.0530.8%

3 讨论

细菌生物被膜的形成过程主要分为4步[10-11]：菌毛、鞭毛等黏附细胞器进行初始黏附、细菌聚集进行不可逆附着、形成成熟的生物被膜、生物被膜内部深层细菌与生物被膜分散后进行再定植，生物被膜形成后对抗菌药物的耐药性增强10～1000倍[12]。而XDRAB生物被膜一旦形成，临床现有的抗菌药物均难以控制，生物被膜菌所引起的院内感染是目前全球医学界所面临的重要难题，寻找新的抗菌药物组合势在必行。实验结果表明，4种抗菌药物与3种中药单体在各自高浓度单用、联用均可以显著抑制XDRAB生物被膜的形成，单药抑制作用槲皮素二水物＞替加环素＞美罗培南＞盐酸小檗碱＞多黏菌素B＞黄芩苷＞亚胺培南，4种抗菌药物亚胺培南、美罗培南、多黏菌素B、替加环素与3种中药单体黄芩苷、盐酸小檗碱、槲皮素二水物在单用及联用时对 XDRAB 的生物被膜形成均具有不同程度的抑制作用，组合用药表现为不同程度的协同抗生物被膜效应。

目前，替加环素与多黏菌素被认为是治疗XDRAB感染的最后一道防线，但是，XDRAB的生物被膜一旦形成，耐药性甚至转变为全耐药，我们旨在通过研究临床特殊使用级抗菌药物与中药单体组合治疗针对XDRAB生物被膜的感染。本研究表明，亚胺培南(4 μg/mL)、美罗培南(2 μg/mL)、多黏菌素B(0.25 μg/mL)、替加环素(0.0625 μg/mL)、黄芩苷(128 μg/mL)、盐酸小檗碱(32 μg/mL)、槲皮素二水物(64 μg/mL)的浓度下显著抑制XDRAB生物被膜的形成，且该工作浓度均不抑制XDRAB生长，谢杰鹏等研究表明[13]，美罗培南通过抑制c-di-GMP进一步抑制铜绿假单胞菌生物被膜的形成。此外，Tahereh等[14]研究证明，替加环素在亚抑菌浓度浓度下通过调控群体感应系统abaI/abaR基因的表达从而抑制生物被膜的形成。盐酸小檗碱作为天然异喹啉生物碱[15]，广泛用于治疗细菌性腹泻及胃肠炎，本研究表明盐酸小檗碱在32和16 μg/mL浓度下均可以明显抑制XDRAB生物被膜的形成，并且临床抗菌药物亚胺培南、美罗培南、多黏菌素B、替加环素与盐酸小檗碱联合应用均具有不同程度的协同抗生物被膜效应，其中2 μg/mL美罗培南与32 μg/mL盐酸小檗碱联用可以有效抑制66%的XDRAB生物被膜的形成。Tong等[16]研究表明盐酸小檗碱在亚抑菌浓度下通过下调大肠埃希菌鞭毛合成基因motA和fliA、外膜蛋白调节基因ompA从而抑制生物被膜的形成。

槲皮素二水物、黄芩苷作为典型黄酮类化合物，具有抗菌、抗病毒、抗氧化等广泛的药理作用[17]。本实验结果显示，槲皮素二水物在64、32和16 μg/mL；黄芩苷在128、64和32 μg/mL浓度下均可以明显抑制XDRAB生物被膜的形成，4种抗菌药物分别与其联用均表现不同程度的协同抗生物被膜作用，其中2 μg/mL的美罗培南联用64 μg/mL槲皮素对XDRAB生物被膜的形成抑制率高达66.6%，而替加环素与黄芩苷的9个浓度组合均能够显著抑制XDRAB生物被膜的形成，联用效果均优于替加环素、黄芩苷单独用药，在0.015625 μg/mL替加环素与32 μg/mL黄芩苷的浓度组合下，药物剂量最小。有研究表明，黄芩苷通过剂量依赖性抑制腐生链球菌中msrA基因的转录水平，从而抑制生物被膜的形成[18]。Du Z等[19]研究表明黄芩苷在亚抑菌浓度下有效阻止了金黄色葡萄球菌生物被膜的形成。Peng等[20]研究结果显示黄芩苷通过干扰禽致病性大肠埃希菌(apeC)群体感应系统、降低lsrB和lsrK等毒力基因表达从而抑制生物被膜的形成。Memariani[21]的综述中指出槲皮素通过降低大肠埃希菌rpoS的表达从而影响大肠埃希菌生物被膜的成熟。Aygül等[22]研究认为槲皮素对奇异变形杆菌可能通过抑制群体感应系统调节基因、编码调节蛋白flhDC从而抑制生物被膜的形成。本课题组前期实验已经证明替加环素与黄芩苷联合对抗XDRAB的协同抗菌效应为100%，本实验进一步证明替加环素与黄芩苷联合应用可协同抑制XDRAB生物被膜形成，抗菌药物联合中药单体通过协同抗菌+协同抗生物被膜的双重作用，实现双靶标对抗XDRAB的耐药性问题，降低了替加环素和黄芩苷单一药物的使用剂量，可有效预防XDRAB对替加环素产生耐药性，为防控泛耐药及全耐药鲍曼不动杆菌感染提供了新的治疗方案，为新型抗菌药物联合中药单体复方制剂的研制提供了实验数据，具有一定参考价值。