miR-223抑制肺结核大鼠肺部病变

童晓维，肖 韩

(宜昌市第三人民医院 肺病科, 湖北 宜昌 443000)

肺结核(pulmonary tuberculosis，PT)只由结核分枝杆菌引发的传染性疾病，对人类的健康造成严重的危害。青壮年是PT的好发人群，中国结核病患者占全球的15%以上，也是结核病高发的国家之一[1]。结核分枝杆菌属于一种寄生菌，当机体发生感染时会在巨噬细胞内寄生，细胞内的结核分枝杆菌会在巨噬细胞凋亡后一起被清除。结核分枝杆菌感染人体一般通过呼吸道传播，感染发生时，人体的细胞免疫功能会对机体进行保护，因此有大部分的患者并不会发病[2]。在肌体细胞中，T细胞主导细胞免疫功能，巨噬细胞可有效反应细胞中的免疫功能。干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)可有效的调节巨噬细胞的活化，白细胞介素-18(interleukin-18，IL-18)可以诱导IFN-γ大量的产生[3]。因此，猜测IFN-γ和IL-18介导着肺结核疾病的免疫调节机制。近年来，在很对真核细胞和病毒中均发现了微小RNA-miRNA，其主要是源自内源性染色体的单链RNA。近年来有研究发现，miRNA对动物体内的炎性反应和免疫机制起到一定的调节作用，同时对多种生物学活性均能进行调节。近些年，随着对miRNA的深入研究，发现结核病患者体内存在特异性miRNA表达[4]。高度保守的miR-223可调控炎性反应，其机制可能是通过抑制其相关靶基因而实现[5]。有报道，miR-223在结核病患者的单核细胞中低表达，巨噬细胞的细胞因子可随着miR-223的低表达而大量产生[6]。由此可见，在肺结核的机体免疫中miR-223起重要作用，但其具体的作用机制尚不明确，因此本文旨探究miR-223对肺结核大鼠肺部病变及IFN-γ蛋白表达的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

SD雄性大鼠60只，清洁级，体质量100～210 g(上海斯莱克实验动物有限公司)[许可证号：SCXK(沪)1012-0002]。

1.2 试剂

结核分枝杆菌(青岛绿谷商贸有限公司)；IL-18和IFN-γ ELISA试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司)；Trizol试剂(浙江联硕生物科技有限公司)；RT-qPCR检测试剂盒(上海优予生物科技有限公司)；引物序列、miR-223 mimics质粒(上海吉玛制药技术有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 动物的分组及处理：将大鼠分为正常组(NC组)；肺结核大鼠模型组(PT组)：经大鼠尾静脉注射0.2 mL结核分枝杆菌悬液；肺结核大鼠给予miR-223 mimics干预组(miR-223组)，每组10只。血液检查及结核菌素试验证实肺结核建模成功后，miR-223组大鼠尾静脉注射miR-223 mimics质粒，2 mg/kg，3组大鼠均连续7 d。

1.3.2 样本的收集：7 d后分别多次抽取大鼠尾静脉血4 mL，分离血清，将血清置入到抗凝管中抗凝后保存用于后续试验。分别脱颈处死大鼠，取出肺组织后，保存用于后续实验。

1.3.3 流式细胞仪检测外周血T细胞亚群：用常规法检测外周血T细胞免疫因子CD3+%、CD4+%、CD8+%的变化。

1.3.4 ELISA检测血清中IFN-γ和IL-18的水平：用ELISA试剂盒检测血清中IFN-γ和IL-18水平。

1.3.5 大鼠肺组织结核分枝杆菌菌落的计数：取肺组织50 mg，制备均浆组织，在组织液中加入4%硫酸消化组织，15 min后加入2.5 mol/L的NaOH，将pH值调至7.0左右，将组织接种于斜面培养基中，培养基温度保持在37 ℃，5周后对培养基上的结核分枝杆菌菌落数进行计数。

1.3.6 HE染色观察肺组织病理学形态：常规制备，HE染色后用显微镜观察。

1.3.7 免疫组化检测肺组织中IFN-γ蛋白表达：切片组织脱蜡，将抗原修复液加入到组织中，在98 ℃的环境下修复组织，15 min后清洗切片组织，用山羊血清将组织封闭，把IFN-γ蛋白一抗加入到组织中，在4 ℃环境中孵育过夜，次日PBS再次清洗组织，将生物素标记的二抗加入到组织中，在37 ℃的环境中孵育，30 min后将DAB溶液滴加到组织内将组织染色，用苏木精将细胞核复染，将组织脱水透明后晾干，用中性树胶将组织封片，显微镜下观察组织中IFN-γ蛋白表达。

1.3.8 RT-qPCR检测肺组织中miR-223、IFN-γ mRNA表达：用胰蛋白酶消化肺组织，Trizol法裂解后对总的RNA进行提取，反转录成cDNA。miR-223引物序列：上游引物5′-GCCGGCGCCCGAGCTCTG GCTC-3′,下游引物5′-TGTCAGTTTGTCAAATACCC CA-3′；IFN-γ引物序列：上游引物5′-AGTTATATCT TGGCTTTTCA-3′，下游引物5′-TTCGACTGATTAAT AAGC-3′。反应条件：分别在60 ℃、95 ℃环境下预变性10 min、30 s；在72 ℃环境下退火30 s；在95 ℃环境下延伸30 s，共计40个循环。miR-223、IFN-γ mRNA相对表达量用2-△△Ct法进行计算。

1.4 统计学分析

应用SPSS 10.1软件对NC组、PT组和miR-223组的数据进行分析。用均数±标准差(x±s)表示，3组间的数据比较用单因素方差法进行检验，两组间比较采用LSD-t进行检验。

2 结果

2.1 外周血T细胞亚群变化的比较

和NC组相比，PT组大鼠外周血T细胞亚群CD3+%、CD4+%水平明显降低，而CD8+%水平升高(P<0.05)；miR-223组大鼠外周血T细胞亚群CD3+%、CD4+%水平较PT组明显回升，而CD8+%水平较PT组明显回降(P<0.05)(表1，图1)。

表1 各组大鼠外周血T细胞亚群CD3+、CD4+、CD8+的变化Table 1 Changes of CD3+、CD4+、CD8+ of T cell subsets in peripheral blood of rats in each group(x±s，%，n=10)

2.2 血清中IFN-γ和IL-18水平变化比较

和NC组大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平比较，PT组显著增加(P<0.05)；干预后的miR-223组大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平较PT组显著降低(P<0.05)(表2，图2)。

表2 各组血清中IFN-γ和IL-18水平比较Table 2 Comparison of serum IFN-γ and IL-18 levels in each group(x±s，pg/mL，n=10)

2.3 肺组织结核分枝杆菌菌落数的比较

miR-223组大鼠肺组织中结核杆菌菌落数为(4.28±1.76/CFU)，低于PT组(9.33±2.15/CFU)(P<0.05)。

2.4 大鼠肺组织病理学形态比较

和正常的NC组相比，PT组肺组织细支气管周围有大量以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润；干预后的miR-223组大鼠肺组织得到明显改善，较PT组肺组织细支气管周围炎细胞大量减少(图1)。

图1 大鼠肺组织病理形态HE染色Fig 1 HE staining of rat lung histopathology(×200)

2.5 大鼠肺组织中IFN-γ蛋白表达比较

和NC组相比较，PT组大鼠IFN-γ蛋白阳性细胞计数显著增加(P<0.05)；干预后的miR-223组大鼠IFN-γ蛋白阳性细胞计数较PT组显著降低(P<0.05)(图2，表3)。

图2 各组大鼠肺组织中IFN-γ蛋白表达免疫组化染色Fig 2 Immunohistochemical staining of IFN-γ protein expression in lung tissues of rats in each group(×200)

表3 各组大鼠肺组织中IFN-γ蛋白表达比较Table 3 Comparison of IFN-γ protein expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

2.6 大鼠肺组织中miR-223、IFN-γ mRNA表达

和NC组大鼠肺组织中miR-223 mRNA表达相比较，PT组显著降低；和NC组肺组织中IFN-γ mRNA表达相比较，PT组显著升高(P<0.05)；干预后的miR-223组大鼠肺组织中miR-223 mRNA表达较PT组显著增加，IFN-γ mRNA表达较PT组明显降低(P<0.05)(表4)。

表4 各组大鼠肺组织中miR-223、IFN-γmRNA表达比较Table 4 Comparison of miR-223 and IFN-γ mRNA expression in lung tissue of rats in each group(x±s，n=10)

3 讨论

肺结核属传染性呼吸系统疾病，当机体被结核分枝杆菌感染后的2～3周，会出现免疫和迟发性的超敏反应，让细菌增殖受到免疫应答抑制。研究发现肺结核发病时，巨噬细胞中被大量炎性因子浸润，因此调节机体的免疫水平，抑制炎性反应导致的肺组织损伤也是治疗肺结核的重中之重[7]。miR-223表达于多种哺乳动物中，其参与细胞增殖及组织生长[8]。miR-223可抑制肺结核患者体内中性粒细胞趋化，减轻肺组织损伤[9]。

免疫功能低下是肺结核的主要发病机制，其中抗结核免疫中CD4+T细胞最为重要[10]。本研究结果显示，PT组CD3+%、CD4+%降低，而CD8+%水平升高，miR-233干预后免疫应答因子均改善，提示miR-233可增强肺结核大鼠机体内免疫功能。机体内活化的巨噬细胞会产生大量的IL-18，进而诱导T淋巴细胞产生IFN-γ的能力[11]。本文研究发现PT组IFN-γ和IL-18水平增多，miR-223干预后IFN-γ和IL-18表达回降，提示miR-223可通过抑制肺结核大鼠血清中IFN-γ和IL-18水平，进而增强机体的免疫功能。研究发现，肺结核患者血清中IL-18和IFN-γ水平升高，炎性因子增多，进而加重了肺结核的免疫反应[12]。miR-223可通过调控基因的表达进而影响免疫细胞的发育和激活，并参与细胞的免疫反应[13]。

本实验结果发现PT组结核分枝杆菌的菌落数增加，miR-233组结核分枝杆菌菌落数明显回降，提示miR-233可减少结核分枝杆菌菌落数数量，改善结核病的严重程度。研究发现，miR-223可减少肺结核大鼠肺组织中结核杆菌菌落数，进而抑制巨噬细胞的凋亡[14]。IFN-γ是肌酸激酶，可有效的激活巨噬细胞，进而抵抗细胞内感染的发生，机体对结核杆菌的杀伤力随着IFN-γ的减少而降低。本研究发现，PT组IFN-γ表达增加，miR-223组中IFN-γ表达回降，提示miR-223可抑制肺结核大鼠肺组织中IFN-γ的表达，增加机体对结核分枝杆菌的杀伤作用，进而改善结核病。嗜中性粒细胞驱动的致死性炎性可通过miR-233进行抑制，进而对白细胞的趋化作用进行调节，介导肺结核及慢性炎性的发生发展。miR-223可抑制巨噬细胞中p65磷酸化，负向调节活化NF-κB，对体内的细胞因子和巨噬细胞的凋亡进行抑制，进而抑制机体内的抗结核免疫[15]。

综上所述，过表达miR-223可抑制结核分枝杆菌引起的肺部炎性反应，具有抗结核杆菌和调节机体免疫的双重作用，同时还能有效抑制肺组织中IFN-γ的表达，进而降低结核病的严重程度。